楊 然 董莉麗 汪愛兵 李英霞 王學(xué)博 孫 麗 馮 磊

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖系統(tǒng)常見的雌激素依賴性上皮性惡性腫瘤,好發(fā)于絕經(jīng)后的老年女性[1]。近年來,隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的提高,EC呈現(xiàn)發(fā)病率逐年上升和發(fā)病年齡年輕化的趨勢,其中多數(shù)年齡低于40歲的育齡患者臨床癥狀出現(xiàn)較早,表現(xiàn)為分化好、局限好和無肌層浸潤等特征[2-3]。目前臨床多采用手術(shù)切除腫瘤病灶對無保留生育功能意向的育齡EC患者進(jìn)行治療,取得了一定的臨床療效,但尚缺乏有效預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)過程的單鏈非編碼小分子RNA,可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲過程參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程,其中微小RNA-29a(microRNA-29a,miR-29a)在胃癌、乳腺癌和EC等多種腫瘤中均呈現(xiàn)異常表達(dá)[4-5]。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),張力蛋白同源物(phosphat and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)和腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene,p53)等抑癌基因的突變、失活與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切[6]。既往研究報(bào)道了EC患者臨床病理特征和免疫組化與預(yù)后的關(guān)系[7],但少見EC患者癌組織miR-29a、PTEN、p53表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的報(bào)道。本研究主要探討分析育齡EC患者癌組織miR-29a、PTEN、p53表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,旨在為育齡EC患者的臨床治療方案制定及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年1月至2018年12月在南陽市中心醫(yī)院因EC進(jìn)行手術(shù)治療42例病理組織標(biāo)本作為研究對象,并納入觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡22～40歲;符合EC診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)病理檢查確診[8];患者及其家屬充分了解手術(shù)治療的利弊并簽署知情同意書;術(shù)前未接受放化療;臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能不全及其它免疫性相關(guān)性疾病;合并凝血功能障礙;合并其他部位惡性腫瘤;合并心理、精神疾病。另選取本院同期行子宮肌瘤切除術(shù)的21例正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本作為研究對象納入對照組。觀察組平均年齡(29.82±2.44)歲,對照組平均年齡(29.75±2.49)歲。兩組年齡無顯著差異(P>0.05)。根據(jù)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移判斷標(biāo)準(zhǔn)將觀察組分為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組19例和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組23例。本研究經(jīng)南陽市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 通過臨床電子病歷系統(tǒng),記錄育齡EC患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、合并多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,POCS)、合并糖尿病、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期、治療方法、腫瘤直徑、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴脈管轉(zhuǎn)移等一般病例資料。

1.2.2 癌組織miR-29a表達(dá)檢測 手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本和正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本用液氮研磨成粉末后,將裂解后樣品或勻漿液冰上放置10 min,使得核蛋白與核酸完全分離,采用Trizol試劑法TIANGEN?RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。取經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的cNDA樣本,使用ABI公司的定量PCR 7300進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為:所有樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,重復(fù)40次。以U6作為內(nèi)參,采用相對定量法分析miR-29a相對表達(dá)量,計(jì)算公式為[2-△△CT,△△CT=(ctmiR-29a-ctU6)腫瘤-(ctmiR-29a-ctU6)正常]。

1.2.3 PTEN、p53表達(dá)檢測及結(jié)果判定 收集患者病理組織標(biāo)本,采用10%中性福爾馬林進(jìn)行常規(guī)固定、脫水后石蠟包埋,4～5 μm切片脫蠟后,暴露抗原并進(jìn)行一抗孵育,60 min后浸于緩沖液中沖洗3次。滴加二抗,水平放置切片,室溫下孵育20 min,沖洗后在切片組織覆蓋區(qū)域滴加顯色試劑顯色,出現(xiàn)棕黃色則終止顯色。滴加蘇木精核染1 min,緩沖液反藍(lán)后自來水下沖洗2 min。依次加入75%、95%和100%酒精脫水2 min,中性樹膠封片。PTEN、p53抗體及試劑相應(yīng)的單克隆抗體購置萊卡公司,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液由泉暉貿(mào)易國際有限公司生產(chǎn),所有操作嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)行。

由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生參與閱片,并采用雙盲法對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定。采用二次計(jì)分法,對每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)具有腫瘤成分的高倍視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)約100個(gè)腫瘤細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度。其中,陽性判定標(biāo)準(zhǔn)[9]:陽性細(xì)胞百分比:≤10%即為0分,11%～25%即為1分,26%～50%記為2分,51%～75%記為3分,>75%記為4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度:無著色記為0分,淡黃色記為1分,棕黃色記為2分,褐色記為3分。免疫組化評分=陽性細(xì)胞百分比評分×細(xì)胞染色強(qiáng)度評分。

1.2.4 術(shù)后隨訪 術(shù)后通過門診和電話進(jìn)行隨訪,術(shù)后1年內(nèi)每2個(gè)月隨訪一次,2年后每4個(gè)月隨訪一次,隨訪截止時(shí)間為2021年12月31日。記錄患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況,總生存期從術(shù)后第一天起至隨訪截止日期或患者死亡。

1.2.5 術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]治療結(jié)束半年后,排除再發(fā)惡性腫瘤的可能后,出現(xiàn)以下任意一項(xiàng)即可診斷:①婦科檢查或影像學(xué)檢查在盆腔、腹腔或遠(yuǎn)處發(fā)現(xiàn)腫瘤占位性病變;②血清腫瘤標(biāo)志物水平呈現(xiàn)持續(xù)增高趨勢;③在出現(xiàn)癌性胸腔積液、腹腔積液的患者胸腔、腹腔積液內(nèi)檢出腫瘤細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對照組miR-29a相對表達(dá)量和PTEN、p53陽性表達(dá)率比較

觀察組miR-29a相對表達(dá)量、PTEN陽性表達(dá)率低于對照組,p53陽性表達(dá)率高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 觀察組與對照組miR-29a相對表達(dá)量和PTEN、p53陽性表達(dá)率比較

2.2 育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與其臨床病理特征的關(guān)系

育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與腫瘤直徑、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴脈管轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05);與年齡、BMI、合并POCS、合并糖尿病、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期無關(guān)(P>0.05),見表2。

2.3 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組miR-29a相對表達(dá)量和PTEN、p53陽性表達(dá)率比較

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組miR-29a相對表達(dá)量、PTEN陽性表達(dá)率低于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,p53陽性表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。見表3。

表2 育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與其臨床病理特征的關(guān)系

表3 兩組miR-29a相對表達(dá)量和PTEN、p53陽性表達(dá)率比較

2.4 影響育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的Logistic多因素分析

對影響育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素進(jìn)行變量賦值,因變量和自變量賦值情況見表4。Logistic回歸分析結(jié)果顯示,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(OR=2.869,P=0.048)、miR-29a<(OR=2.807,P=0.028)、PTEN陽性(OR=2.489,P=0.0449)和P53陽性(OR=2.762,P=0.021)均為影響育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4、表5。

表4 因變量和自變量賦值情況

表5 影響育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的Logistic多因素分析

3 討論

育齡EC是發(fā)病率僅次于乳腺癌、宮頸癌的女性常見惡性腫瘤,近年來,其發(fā)病率隨生活方式的變化呈現(xiàn)逐年增高和發(fā)病年齡年輕化的趨勢[11]。手術(shù)是無保留生育意向的育齡EC患者首選的治療方法,部分患者在積極手術(shù)治療后仍發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,對預(yù)后造成影響[12]。miRNA通過抑制翻譯靶基因mRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程,其中位于染色體FRA7H位點(diǎn)的miR-29a在癌細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn),PTEN、p53等抑癌基因和原癌基因與EC的發(fā)病機(jī)制和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[14]。本研究主要探討分析育齡EC患者癌組織miR-29a、PTEN、p53表達(dá)與保育治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組miR-29a相對表達(dá)量、PTEN陽性表達(dá)率低于對照組,p53陽性表達(dá)率高于對照組,說明miR-29a、PTEN、p53在育齡EC患者癌組織中呈現(xiàn)表達(dá)異常。miR-29a通過調(diào)節(jié)多種靶基因發(fā)揮其抑癌功能,其中有多種抗凋亡分子參與其中[15]。PTEN可使腫瘤細(xì)胞周期停滯在G1期,對腫瘤細(xì)胞生長具有負(fù)向調(diào)控作用,同時(shí)通過抑制細(xì)胞有絲分裂、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[16-17]。p53是野生型腫瘤抑制蛋白,可通過阻礙細(xì)胞周期,達(dá)到抑制腫瘤血管生成的作用。但其在基因突變后轉(zhuǎn)為致癌基因,失去對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。本研究中育齡EC患者癌組織中p53陽性表達(dá)率較正常子宮內(nèi)膜組織中升高,提示免疫組化法檢測出的p53可能為突變型。本研究中,育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與腫瘤直徑、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴脈管轉(zhuǎn)移有關(guān),提示育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能與腫瘤直徑、浸潤深度和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組miR-29a相對表達(dá)量、PTEN陽性表達(dá)率低于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,p53陽性表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,說明育齡EC患者miR-29a、PTEN、p53呈現(xiàn)異常表達(dá),其表達(dá)異?？赡茴A(yù)示著育齡EC患者預(yù)后不良。PTEN是即有雙重磷酸酶活性的抑癌基因,其基因突變可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)性增殖,影響腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[19]。p53是具有抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)DNA損傷修復(fù)作用的家族成員,作為與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因,其基因突變可導(dǎo)致編碼蛋白功能喪失,誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[20]。大量研究顯示p53陽性表達(dá)導(dǎo)致的蛋白功能缺失是其主要特征性改變,與EC呈正相關(guān)關(guān)系[21]。本研究中采用Logistic多因素分析影響育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素,結(jié)果顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、miR-29a<1.92、PTEN陽性和P53陽性均為影響育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步證實(shí)了育齡EC患者癌組織miR-29a、PTEN、p53表達(dá)與其術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示臨床應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注miR-29a相對表達(dá)量、PTEN陽性表達(dá)率顯著降低和和P53陽性表達(dá)率顯著升高的育齡EC患者,針對性給予有效的干預(yù)措施,降低術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,miR-29a、PTEN、p53在育齡EC患者癌組織中呈現(xiàn)表達(dá)異常,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、miR-29a<1.92、PTEN陽性和P53陽性均為影響育齡EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究的不足之處在于樣本例數(shù)較少,未對miR-29a、PTEN、p53表達(dá)情況與育齡EC患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行具體分析,后續(xù)仍需加大樣本量深入研究驗(yàn)證。