趙蓓蓓 吳 帥

食管癌是消化道常見惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率均較高,早期癥狀不明顯,診斷困難,70%～80%患者確診時已為中晚期,臨床主要通過手術(shù)、放療和化療等方式進(jìn)行治療,但治療效果不甚滿意,5年生存率仍較低。因此,進(jìn)行癌前病變及早期病變篩查具有重要意義,尋找有效的生物標(biāo)志物,對于早期篩查及診斷至關(guān)重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼小分子RNA,可通過調(diào)控靶基因,參與體內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。miRNA與癌基因或抑癌基因關(guān)系密切,可作為腫瘤早期診斷的基礎(chǔ),多種miRNA已被證實(shí)可作為乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤早期診斷標(biāo)志物及靶向治療靶點(diǎn)[1-2]。miR-27a與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān),已有研究顯示其在食管鱗狀癌細(xì)胞增殖和遷移過程中發(fā)揮調(diào)控作用[3]。miR-138-5p在多種腫瘤中表達(dá)異常,與非小細(xì)胞肺癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征有關(guān),但其在食管癌中的作用報(bào)道尚少[4]。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測食管癌患者及正常人血清miR-27a、miR-138-5p表達(dá)水平,探討其對食管癌早期診斷價值及與病理特征的關(guān)系,旨在為臨床食管癌早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2019年8月至2020年8月本院收治的食管癌患者73例,設(shè)為研究組。其中男性41例,女性32例,年齡38～76歲,平均年齡(65.23±5.26)歲;食管癌分段標(biāo)準(zhǔn)[5]:食管上段16例,中段32例,下段25例;TNM分期[6]:Ⅰ期19例,Ⅱ期32例,Ⅲ期13例,Ⅳ期9例。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《食管癌診療規(guī)范》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn);②內(nèi)鏡檢查及組織活檢確診為食管癌;③首次確診,未接受過手術(shù)、放化療及其他抗癌治療;④相關(guān)影像學(xué)及內(nèi)徑資料,可進(jìn)行腫瘤分期。排除標(biāo)準(zhǔn):①年齡<18歲;②合并其他腫瘤;③合并嚴(yán)重慢性基礎(chǔ)性疾病或感染性疾病;④孕婦及哺乳期婦女。另選取同期本院體檢的健康人群59例,設(shè)為對照組,其中男性32例,女性27例,年齡35～78歲,平均年齡(66.21±5.89)歲,對照組人員體檢結(jié)果均正常,無既往腫瘤史。研究組與對照組年齡、性別構(gòu)成比無顯著差異(P>0.05)。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過,所有參與者均對研究內(nèi)容知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑:Trizol試劑(美國Invitrogen公司),SYBR Green qPCR Mix(德國merck公司),ThemoScript RT試劑盒(美國Invitrogen公司)。主要儀器:紫外分光光度計(jì)(德國Sartorius公司),PCR儀(美國Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理 分別采集兩組受試者清晨空腹肘靜脈血5 mL,抗凝管內(nèi)靜置30 min,3500 r/min離心室溫15 min,取上清,-80 ℃保存。

1.3.2 血清總RNA提取 取保存血清樣本,解凍后加入Trizol試劑,充分混勻,12000 r/min離心5 min,加入氯仿室溫放置5 min,加入異丙醇室溫放置10 min,離心取上清,提取血清總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測定260 nm和280 nm處吸光度(A)值,檢測RNA濃度和純度,A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之間,表示提取的總RNA純度較高,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:1 μL總RNA,1 μL dNTP Mixture,2 μL 5×RT Buffer,0.5 μL RNA酶抑制劑,1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶,加ddH2O至總體積20 μL。45 ℃反應(yīng)30 min,85 ℃反應(yīng)5 min。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增。配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq II 10 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA模板3 μL,加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 5 s,40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參,2-△△CT法對miR-27a,miR-138-5p進(jìn)行相對定量,重復(fù)檢測3次,取平均值。實(shí)驗(yàn)所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2組血清miR-27a、miR-138-5p水平比較

研究組血清miR-27a表達(dá)水平高于對照組,miR-138-5p表達(dá)水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清miR-27a、miR-138-5p水平比較

2.2 血清miR-27a、miR-138-5p表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

血清miR-27a、miR-138-5p在不同年齡、性別、腫瘤位置及病理類型患者中表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著病理分化程度升高,血清miR-27a表達(dá)水平降低、miR-138-5p表達(dá)水平升高(P<0.05);淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移患者血清miR-27a高于未轉(zhuǎn)移患者、miR-138-5p表達(dá)水平低于未轉(zhuǎn)移患者(P<0.05);TNM分期IV期患者miR-27a表達(dá)水平最高、miR-138-5p表達(dá)水平最低,I-II期患者miR-27a表達(dá)水平最低、miR-138-5p表達(dá)水平最高,各期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-27a、miR-138-5p表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清miR-27a,miR-138-5p單獨(dú)及聯(lián)合檢測對食管癌早期診斷價值

ROC結(jié)果顯示,血清miR-27a,miR-138-5p單獨(dú)診斷早期食管癌的最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為7.32、2.51,單獨(dú)及聯(lián)合診斷的AUC分別為0.786、0.725、0.813,見表4,圖1。

表4 血清miR-27a,miR-138-5p單獨(dú)及聯(lián)合檢測對食管癌的早期診斷價值

圖1 miR-27a,miR-138-5p單獨(dú)及聯(lián)合檢測預(yù)測食管癌的ROC曲線

3 討論

食管癌早期診斷與治療是降低患者死亡率的關(guān)鍵,目前臨床食管癌診斷采用內(nèi)鏡活檢,患者依從性差,且存在醫(yī)源性感染,外周血獲取簡單,創(chuàng)傷較小,患者容易接受,血清miRNAs在腫瘤早期篩查和診斷中具有廣泛應(yīng)用前景[8]。miRNA在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,通過靶向降解下游癌基因或抑癌基因,從上游抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展,部分miRNAs可作為腫瘤發(fā)生發(fā)展標(biāo)志物,為腫瘤靶向治療提供潛在靶點(diǎn)[9]。鑒于此,本研究檢測食管癌患者與健康人群血清miR-27a、miR-138-5p表達(dá)水平,分析兩者對食管癌早期診斷的應(yīng)用價值,結(jié)果顯示,食管癌患者血清miR-27a表達(dá)水平顯著高于正常人群,miR-138-5p表達(dá)水平顯著低于正常人群,與Maghsudlu等[10]報(bào)道的miR-27a在食管癌腫瘤組織中表達(dá)較高結(jié)果一致,Wang等[11]研究顯示,miR-138-5p在胃癌組織中表達(dá)下調(diào),本研究在食管癌中也得到相似驗(yàn)證,表明miR-27a、miR-138-5p與食管癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

血清miRNA不易受外界環(huán)境影響,能夠長期保存,性質(zhì)穩(wěn)定,對于臨床動態(tài)觀察患者病情具有重要價值。血清miRNA與腫瘤生長有關(guān),惡性腫瘤患者血清miRNA表達(dá)水平在根治性切除治療后,可逐漸升高/降低,miRNA表達(dá)水平可在一定程度預(yù)測腫瘤負(fù)荷[12]。腫瘤發(fā)展不同階段,miRNA譜系表達(dá)不同,可根據(jù)差異推測腫瘤惡性進(jìn)展程度[13]。此外,血清miRNA還存在一定特異性,不同病理類型惡性病變,其miRNA表達(dá)譜系表達(dá)存在差異,有助于分析臨床中來源不明的低分化惡性病變[14]。miRNA異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),本研究分析血清miR-27a、miR-138-5p表達(dá)水平與患者臨床特征關(guān)系,結(jié)果顯示,病理分化程度越高,miR-27a表達(dá)水平降低、miR-138-5p表達(dá)水平升高;并且淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移患者血清miR-27a高于未轉(zhuǎn)移患者、miR-138-5p表達(dá)水平低于未轉(zhuǎn)移患者;Ⅳ期患者miR-27a表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ期患者,而miR-138-5p表達(dá)水平較低,表明miR-27a、miR-138-5p表達(dá)在食管癌中具有較高敏感度,與食管癌惡性程度有關(guān)。

食管癌臨床特征發(fā)展不穩(wěn)定,進(jìn)展過程中有多個基因共同參與調(diào)控,目前臨床常用的血清腫瘤標(biāo)志物鱗狀細(xì)胞癌抗原、C反應(yīng)蛋白和細(xì)胞角蛋白19片段等,存在特異性不高、靈敏度差等問題,尤其對食管癌早期病變診斷價值不明顯。本研究進(jìn)一步采用ROC曲線分析miR-27a、miR-138-5p在食管癌中的診斷價值,結(jié)果顯示,血清miR-27a、miR-138-5p單獨(dú)及聯(lián)合診斷早期食管癌的AUC分別為0.786、0.725、0.813,當(dāng)臨界值取7.32時,miR-27a對食管癌診斷價值最大,靈敏度和特異度分別為80.82%、81.36%;當(dāng)臨界值取2.51時,miR-138-5p對食管癌診斷的靈敏度和特異度分別為76.71%、77.97%,表明血清miR-27a、miR-138-5p是食管癌惡性程度增高的敏感指標(biāo),對食管癌具有一定診斷價值,兩者聯(lián)合檢測診斷價值更高。此外,miR-27a在大腸癌及卵巢癌患者中表達(dá)升高,診斷腫瘤敏感度較高,但特異性較低[15]。聯(lián)合miR-138-5p后,可提高診斷價值,有望成為診斷早期食管癌的分子標(biāo)志物。

綜上所述,血清miR-27a在食管癌患者血清表達(dá)升高、miR-138-5p表達(dá)下降,與腫瘤病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān),兩者聯(lián)合檢測可為食管癌早期診斷提供依據(jù)。但本次研究樣本量較少,進(jìn)一步可利用miR-27a、miR-138-5p在食管癌進(jìn)展中表達(dá)失調(diào),研究其可能作用機(jī)制及靶點(diǎn),為臨床靶向治療食管癌提供潛在靶點(diǎn)。