趙 玲 彭 湃 馮沛貝 易善永

肺癌是臨床常見的原發(fā)性惡性腫瘤,常發(fā)于60歲以上男性,其發(fā)病率及病死率均居我國惡性腫瘤首位,以發(fā)病隱匿、遠端轉移迅速為主要特征[1]。近年來,鐵死亡理論在腫瘤治療的各項研究中嶄露頭角,作為腫瘤治療新方向被眾多學者所關注。重樓皂苷是中藥重樓主要藥理成分之一,具有抑菌、抗炎、抗病毒等多種藥理活性[2]。有研究表明[3],其可有效抑制人骨肉瘤U2OS細胞活性、促進自噬及凋亡,從而發(fā)揮其抗腫瘤功效。本研究采用重樓皂苷干預人肺癌A549細胞,觀察其對該細胞鐵死亡的影響,并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肺癌A549細胞株,購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

重樓皂苷(純度:98%)、鐵死亡誘導劑Erastin(上海源葉生物科技有限公司),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminal kinase,JNK)/p53信號通路抑制劑SP600125[愛必信(上海)生物科技有限公司],丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、雙染細胞凋亡試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司),兔抗人溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)、JNK、p-JNK、p53一抗(美國CST公司)。

Infinite 200 pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司),IX51倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司),FACS Aria流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)

取A549細胞株恒溫37 ℃水浴解凍,在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)中,培養(yǎng)箱標準條件下(37 ℃,5%CO2)培育,待細胞融合至80%,消化傳代培養(yǎng),取對數(shù)期細胞作為后續(xù)實驗對象。實驗均設置5個復孔,取均值。

1.4 細胞分組、處理[4-5]

取對數(shù)期A549細胞,清洗、重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個/mL接種至6孔板,待細胞融合至80%,分為對照組、重樓皂苷組、SP600125組、聯(lián)合組。對照組完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),重樓皂苷組培養(yǎng)基加入重樓皂苷(終濃度4 g/L),SP600125組培養(yǎng)基加入SP600125(終濃度10 μmol/L),聯(lián)合組培養(yǎng)基加入重樓皂苷(4 g/L)及SP600125(10 μmol/L)。取干預48 h后的細胞作為后續(xù)實驗對象。

1.5 MTT實驗檢測細胞鐵死亡抗性

取干預后各組細胞,PBS重懸,以1×105個/mL接種于96孔板,正常孵育24 h后,加入Erastin劑1 μmol/L誘導鐵死亡,24 h后各孔加入新配置MTT溶液(5.00 g/L)100 μL,2 h后吸棄上清,加入150 μL DMSO,振蕩10 min后靜置,酶標儀檢測各孔490 nm位置吸光度值,以各孔吸光度值與對照孔吸光度值之比代表各孔細胞鐵死亡相對抗性。

1.6 熒光探針法檢測細胞內(nèi)ROS堆積

取干預后各組細胞,PBS重懸,以1×106個/mL接種至6孔板,將DCFH-DA熒光探針以1∶1 000避光溶解于無血清培養(yǎng)基,每孔各滴加500 μL,培養(yǎng)箱標準條件下繼續(xù)孵育20 min,吸棄原DCFH-DA熒光探針培養(yǎng)基,PBS清洗3次,加入完全培養(yǎng)基,熒光顯微鏡觀察紅色熒光細胞即為ROS陽性細胞,拍照并統(tǒng)計各組視野內(nèi)陽性細胞數(shù)。

1.7 細胞MDA水平檢測

取干預后各組細胞,PBS清洗,以1×106個/mL接種至6孔板,低溫離心5 min(1000 r/min,r=8 cm)后棄上清,滴加提取液超聲碎裂細胞,低溫離心10 min(10 000 r/min,r=8 cm)取上清,根據(jù)細胞內(nèi)MDA檢測試劑盒說明操作實驗步驟,經(jīng)比色法測定各組細胞MDA水平。

1.8 Western blot法檢測細胞鐵死亡相關蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表達

取干預后的各組細胞,PBS清洗,加入RIPA裂解細胞并注入離心管內(nèi),低溫離心15 min(10 000 r/min,r=10 cm),取沉淀物經(jīng)BCA法定量蛋白。取微量待測蛋白,以1∶5體積比與SDS-PAGE上樣緩沖液混勻,水浴加熱變性蛋白,離心取其上清,恒壓80 V電泳分離并濕轉至硝酸纖維素膜,加入BSA液封閉2 h,加入兔抗人SLC7A11、GPX4一抗(1∶500),4 ℃冰箱過夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常溫孵育2 h,TBST清洗,ECL液發(fā)光,暗盒顯影,凝膠分析儀分析蛋白條帶灰度值,以SLC7A11、GPX4蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示細胞SLC7A11、GPX4相對蛋白表達量。

1.9 流式細胞術檢測細胞凋亡率

取干預后的各組細胞,PBS清洗、重懸,以1×106個/mL接種至6孔板,完全培養(yǎng)液標準環(huán)境下培養(yǎng)48 h,PBS清洗,低溫離心5 min(1000 r/min,r=8 cm)后棄上清,根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒說明書要求設計并操作實驗過程,binding buffer液懸浮細胞,加入5 μL Annexin V-FITC避光染色15 min,再加入5 μL PI液雙染,經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,計算各組細胞凋亡率。

1.10 Western blot法檢測細胞JNK、p-JNK、p53蛋白表達

取干預后的各組細胞,清洗、裂解、離心、定量、電泳、轉膜、封閉同1.8,加入兔抗人JNK、p-JNK、p53一抗(1∶500),4 ℃冰箱過夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常溫孵育2 h,TBST清洗,ECL液發(fā)光,暗盒顯影,凝膠分析儀分析蛋白條帶灰度值,以JNK、p-JNK、p53蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示細胞JNK、p-JNK、p53相對蛋白表達量,計算p-JNK/JNK。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 細胞鐵死亡抗性比較

與對照組比較,重樓皂苷組鐵死亡抗性降低(P<0.05),SP600125組鐵死亡抗性升高(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組鐵死亡抗性升高(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組鐵死亡抗性降低(P<0.05),見表1。

表1 各組細胞鐵死亡抗性比較

2.2 細胞內(nèi)ROS堆積比較

與對照組比較,重樓皂苷組ROS陽性細胞數(shù)增加(P<0.05),SP600125組ROS陽性細胞數(shù)減少(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組ROS陽性細胞數(shù)減少(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組ROS陽性細胞數(shù)增加(P<0.05),見表2。

表2 各組ROS陽性細胞數(shù)比較個)

2.3 細胞內(nèi)MDA水平比較

與對照組比較,重樓皂苷組細胞內(nèi)MDA水平升高(P<0.05),SP600125組細胞內(nèi)MDA水平降低(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組細胞內(nèi)MDA水平降低(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組細胞內(nèi)MDA水平升高(P<0.05)。見表3。

2.4 各組細胞鐵死亡相關蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表達比較

與對照組比較,重樓皂苷組SLC7A11、GPX4蛋白表達降低(P<0.05),SP600125組SLC7A11、GPX4蛋白表達升高(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組SLC7A11、GPX4蛋白表達升高(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組SLC7A11、GPX4蛋白表達降低(P<0.05)。見表4,圖1。

表4 各組細胞鐵死亡相關蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表達比較

2.5 各組細胞凋亡率比較

與對照組比較,重樓皂苷組細胞凋亡率升高(P<0.05),SP600125組細胞凋亡率降低(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組細胞凋亡率降低(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表5,圖2。

圖1 細胞SLC7A11、GPX4蛋白表達

表5 各組細胞凋亡率比較

圖2 細胞凋亡流式圖

2.6 各組細胞p-JNK/JNK及p53蛋白表達比較

與對照組比較,重樓皂苷組p-JNK/JNK及p53蛋白表達升高(P<0.05),SP600125組p-JNK/JNK及p53蛋白表達降低(P<0.05);與重樓皂苷組比較,聯(lián)合組p-JNK/JNK及p53蛋白表達降低(P<0.05);與SP600125組比較,聯(lián)合組p-JNK/JNK及p53蛋白表達升高(P<0.05)。見表6,圖3。

3 討論

肺癌是源自支氣管黏膜上皮的一種呼吸道癌癥,右肺上葉是最常見發(fā)病位置,可沿支氣管壁向外擴張,逐步占領周圍肺組織,后浸潤至胸膜外部,通過淋巴及血液轉移至其他臟器[6]。肺癌的早期癥狀并不明顯,常表現(xiàn)為咳嗽、痰中帶血、低熱、胸部脹痛等典型呼吸系統(tǒng)疾病癥狀,后期則表現(xiàn)為頸部水腫、聲音嘶啞及呼吸困難,多伴隨異位激素分泌綜合征,且根據(jù)遠端轉移臟器的不同,伴發(fā)阻塞性肺炎、腰痛、心包積液甚至腦皮質(zhì)變性[7]。吸煙是肺癌發(fā)病的首要危險因素,其因素亦包括粉塵環(huán)境、電離輻射、慢性呼吸道疾病等。鐵死亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡模式,因細胞攝入鐵離子增多,鐵離子被轉化為亞鐵離子,同時使細胞內(nèi)大量生成脂質(zhì)ROS,氧化應激反應加劇,造成脂質(zhì)過氧化物如MDA堆積,從而導致細胞死亡,肺癌細胞長期處于高氧環(huán)境下,且需要吸收更多鐵離子以提高自身增殖性,以致其對鐵死亡尤為敏感[8]。因此,誘導肺癌細胞鐵死亡或可成為肺癌化療耐受患者新的治療方式。

表6 各組細胞p-JNK/JNK及p53蛋白表達比較

圖3 細胞p-JNK、JNK、p53蛋白表達

SLC7A11屬于溶質(zhì)載體家族,是鐵死亡重要的調(diào)控因子,作為細胞膜重要的氨基酸轉運體,可等量比例排出細胞內(nèi)谷氨酸并輸入胱氨酸[9]。GPX4是細胞內(nèi)重要的促還原酶,可促進胱氨酸合成還原劑谷胱甘肽,從而抑制細胞內(nèi)氧化應激反應,抑制細胞鐵死亡[10]。中醫(yī)將肺癌歸為“肺巖”、“痞癖”、“胸痛”等癥范疇,其主要病機為正氣不足、邪氣踞之,肺為嬌臟,不耐六淫,客邪留滯于肺,蘊積生熱、氣陰兩虛,肺失宣降、津血凝滯、痰瘀內(nèi)生,熱毒痰瘀搏結,積聚成癌,故治療應以清熱解毒、化瘀通絡為主[11]。中藥重樓取自百合科重樓屬植物華重樓、云南重樓及七葉一枝花干燥根莖,性微寒、味苦、微毒,歸肝經(jīng),可祛毒、清熱,治疔瘡癌腫,明代藥學家蘭茂言其可攻各種瘡毒癰疽,主治一切無名腫毒[12]。重樓皂苷是提取自重樓根莖內(nèi)的一種甾體皂苷,可促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應、停滯腫瘤細胞周期并抑制血管新生,從而發(fā)揮其抑癌功效。Zhou等[13]研究認為,重樓皂苷可增強三陰性乳腺癌細胞鐵敏感,誘導其鐵死亡,提示其或可成為惡性腫瘤誘導鐵死亡治療的新藥物。本研究結果顯示,與對照組比較,重樓皂苷組鐵死亡抗性,SLC7A11、GPX4蛋白表達降低,ROS陽性細胞數(shù)增加,細胞內(nèi)MDA水平、細胞凋亡率升高,提示重樓皂苷可促進肺癌細胞氧化應激反應及細胞凋亡,誘導鐵死亡。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員,在細胞生長、分化、凋亡、氧化應激、線粒體功能異常及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[14]。p53是JNK通路下游重要的抑癌因子,參與細胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷修復、細胞死亡等多個細胞過程,可下調(diào)鐵死亡相關因子SLC7A11表達,誘導高氧環(huán)境肺癌細胞鐵死亡[15]。王俊巖等[16]研究認為,抑制JNK/p53通路可抑制心肌細胞鐵死亡,進而改善慢性心衰小鼠心功能,提示JNK/p53通路在細胞鐵死亡方面的作用。本研究結果顯示,與對照組比較,重樓皂苷組p-JNK/JNK及p53蛋白表達升高,且在重樓皂苷基礎上增用JNK/p53通路抑制劑SP600125可減弱重樓皂苷對肺癌的治療作用,提示重樓皂苷可能通過介導該通路誘導肺癌細胞鐵死亡。

綜上所述,重樓皂苷可促進肺癌細胞氧化應激反應及細胞凋亡,誘導其鐵死亡,其作用機制可能與激活JNK/p53信號通路有關。