葉曉娟,吳 喆,林 麗**

(1.武漢市江岸區(qū)婦幼保健院,湖北 武漢 430014;2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

乳腺癌(BRCA)是女性最常見的惡性腫瘤之一,約占全球所有癌癥病例的23.1%,死亡人數(shù)的11.6%[1]。越來越多的研究證實(shí)[2-4],雌激素在BRCA發(fā)病機(jī)制中起重要作用,絕經(jīng)后婦女雌激素水平異常升高,會(huì)增加患BRCA的風(fēng)險(xiǎn),抑制雌激素的表達(dá)可以有效控制BRCA的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

阿那曲唑是一種非甾體芳香化酶抑制劑,適用于晚期乳腺癌絕經(jīng)后婦女,同時(shí)也適用于絕經(jīng)后婦女雌激素受體陽性的早期乳腺癌的輔助治療。對(duì)雌激素受體陰性的患者,如果對(duì)他莫昔芬呈現(xiàn)陽性的臨床反應(yīng),仍可以考慮使用阿那曲唑[5]。Forbes等[6]的雙盲隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果表明,阿那曲唑輔助治療激素受體陽性早期BRCA絕經(jīng)后婦女的臨床療效與他莫昔芬一樣,患者耐受性也較好。

生物信息學(xué)分析為減少冗余的實(shí)驗(yàn)提供了方便和有用的方法,利用腫瘤基因圖譜(cancer genome atlas,TCGA)等大數(shù)據(jù),借助現(xiàn)有的藥物信息來預(yù)測(cè)癌癥中可能的基因表達(dá)變化以及發(fā)掘新的治療/診斷生物標(biāo)記物是勢(shì)在必行的[7-8]。因此,本研究通過cBioPortal、GSCALite和UALCAN等生物信息學(xué)工具分析阿那曲唑的靶基因及其臨床意義,為阿那曲唑甚至其他抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)和機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 阿那曲唑的藥物作用靶基因分析

基于Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca),篩查阿那曲唑的分子信息,并識(shí)別其藥物作用靶基因。

1.2 阿那曲唑靶基因的關(guān)聯(lián)基因分析

基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/),選擇“TCGA-BRCA”進(jìn)行基因集分析,鑒定與阿那曲唑靶顯著關(guān)聯(lián)的基因。

1.3 阿那曲唑靶基因的作用網(wǎng)絡(luò)及富集通路分析

基于GSCALite數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/ web/GSCALite/#shiny-tab-drug),分析阿那曲唑靶基因的作用網(wǎng)絡(luò)及富集通路。

1.4 阿那曲唑靶基因的生存分析

通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cbioportal.org)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcga-data.nci.nih.gov)中乳腺浸潤(rùn)性癌996例,數(shù)據(jù)的使用符合TCGA的出版要求。按CYP19A1基因突變情況,將996例病例資料分為兩組,收集診斷中位年齡、性別、腫瘤分期等臨床信息。基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu),分析從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的人BRCA中阿那曲唑靶基因的基因組數(shù)據(jù),并應(yīng)用Kaplan-Meier(KM)曲線進(jìn)行生存分析。

1.5 阿那曲唑靶基因在不同組織的蛋白表達(dá)圖譜

基于TCGA和人類蛋白圖譜(human protein atlas,HPA)的數(shù)據(jù),獲得CYP19A1蛋白在腫瘤組織/器官中的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,生存分析采用KM曲線和Log-rank檢驗(yàn)法,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 阿那曲唑的直接作用靶基因

Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,阿那曲唑是一種小分子芳香化酶抑制劑類藥物,只有一個(gè)作用靶基因CYP19A1,它是芳香化酶的編碼基因,其功能是作為芳香化酶抑制劑。

2.2 CYP19A1及其相關(guān)基因的表達(dá)、作用網(wǎng)絡(luò)及富集通路分析結(jié)果

BRCA病例樣本中與CYP19A1直接相關(guān)的前5個(gè)基因,依次是FGF7(r=0.49)、MMRN1(r=0.40)、LYVE1(r=0.37)、HBS1L(r=0.34)和DGAT2(r=0.34)。mRNA表達(dá)分析結(jié)果表明,CYP19A1、HBS1L基因在正常組織中高表達(dá),在腫瘤組織中低表達(dá)(圖1)?？截悢?shù)變異(copy number variants,CNV)分析結(jié)果表明,BRCA中上述基因的主要突變類型為雜合擴(kuò)增(heterozygous amplification)和雜合缺失(heterozygous deletion),雜合缺失比雜合擴(kuò)增更易引起基因變異(圖2B);從圖2C可以看出,與其他基因相比,HBS1L基因表達(dá)水平與CNV改變的關(guān)聯(lián)更顯著。圖3是這些基因的通路富集結(jié)果,分別顯示了它們?cè)谏婕白铒@著的凋亡、細(xì)胞周期、激素AR等重要通路中的表達(dá)差異。圖4是預(yù)測(cè)得到的這些基因相關(guān)的miRNA網(wǎng)絡(luò),點(diǎn)的大小代表與之有關(guān)聯(lián)的顯著性功能的數(shù)量多少,點(diǎn)越大,代表與之有關(guān)聯(lián)的顯著性功能數(shù)量越多,推測(cè)其越重要,是網(wǎng)絡(luò)中核心的miRNA,可作為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)象以及進(jìn)一步的分析。

A:腫瘤與正常差異表達(dá);B:亞型。圓的大小表示FDR值,圓的顏色顯示log2 FC,值越大、顏色越深圖1 mRNA表達(dá)

A:CNV百分率圖譜,HETE Amp(淺紅色)代表雜合擴(kuò)增;HETE Del(淺綠色)代表雜合缺失;Homo Amp(深紅色)代表純合擴(kuò)增;Homo Del(深綠色)代表純合缺失;None(灰色)代表無CNV;B:CNV雜合點(diǎn)圖譜,藍(lán)色代表CNV缺失,紅色代表CNV擴(kuò)增,點(diǎn)越大突變率越大;C:CNV與mRNA的Pearson相關(guān)性RSEM,藍(lán)色代表正相關(guān),紅色代表負(fù)相關(guān),顏色越深相關(guān)性越強(qiáng),斑點(diǎn)越大越顯著圖2 拷貝數(shù)變化

圖4 miRNA網(wǎng)絡(luò)(節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度呈正相關(guān))

2.3 BRCA中CYP19A1的表達(dá)及生存分析結(jié)果

阿那曲唑靶基因CYP19A1與BRCA之間的關(guān)系見表1、圖5～6。表1顯示了1978—2020年996例乳腺浸潤(rùn)性癌患者的臨床特征,CYP19A1突變組(12例)、未突變組(984例)的中位總生存期分別為17.99月、27.52月(P=0.331)。圖5顯示了CYP19A1基因在乳腺腫瘤樣本與正常樣本中的相對(duì)表達(dá),且在不同組織(正?；蚰[瘤)、癌癥分期、患者年齡、癌癥亞類和更年期狀態(tài)的表達(dá)均有顯著差異(P均<0.05)。生存分析結(jié)果表明,CYP19A1高表達(dá)組總生存期短于低表達(dá)組和中等表達(dá)組(P=0.62),見圖6A;CYP19A1表達(dá)水平對(duì)不同絕經(jīng)狀況BRCA患者的生存具有顯著影響(P=0.016),見圖6B。

表1 TCGA數(shù)據(jù)中996例BRCA患者臨床特征

A:顯示CYP19A1在正常和BRCA樣本中相對(duì)表達(dá);B:根據(jù)個(gè)體的癌癥分期顯示CYP19A1在BRCA中的相對(duì)表達(dá);C:根據(jù)患者年齡顯示CYP19A1在BRCA中的相對(duì)表達(dá);D:顯示CYP19A1在正常、luminal、HER2陽性和三陰性BRCA患者中的相對(duì)表達(dá);E:顯示CYP19A1在正常、絕經(jīng)前、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后患者中的相對(duì)表達(dá)圖5 CYP19A1在BRCA病例樣本中的相對(duì)表達(dá)

A:CYP19A1表達(dá)水平對(duì)BRCA患者生存的影響;B:CYP19A1表達(dá)水平對(duì)不同絕經(jīng)狀況BRCA患者生存的影響圖6 Kaplan-Meier曲線圖顯示CYP19A1表達(dá)與患者存活率的關(guān)系

2.4 CYP19A1蛋白在各器官的表達(dá)結(jié)果

阿那曲唑靶基因CYP19A1蛋白在正常和腫瘤組織/器官中的表達(dá)情況見圖7。結(jié)果顯示,CYP19A1在ER+BRCA患者胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)/膜高表達(dá);413例女性胎盤中高表達(dá)CYP19A1的滋養(yǎng)層細(xì)胞可高達(dá)45%。

A:30歲女性BRCA患者(編號(hào):2515)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞CYP19A1表達(dá);B:31歲女性BRCA患者(編號(hào):337)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞CYP19A1表達(dá)圖7 CYP19A1蛋白在正常和腫瘤組織/器官中的表達(dá)結(jié)果

3 討 論

阿那曲唑是第三代芳香化酶抑制劑類藥物。體內(nèi)外研究均顯示[5,9-10],阿那曲唑能有效抑制雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化;而絕經(jīng)后婦女的雌激素主要來源于雄激素前體物質(zhì)在外周組織的芳香化,由于阿那曲唑選擇性較高,不影響糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素和甲狀腺功能,其大劑量使用對(duì)腎上腺皮質(zhì)類固醇類物質(zhì)的分泌無抑制作用,故該類藥物特別適用于絕經(jīng)后的乳腺癌患者。雌激素濃度是BRCA的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素,這種聯(lián)系的機(jī)制尚不清楚;有學(xué)者認(rèn)為其中一些變體可能會(huì)改變芳香化酶的表達(dá)和/或活性。CYP19A1是芳香化酶的編碼基因,芳香化酶是雌激素合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶,芳香化酶抑制劑類藥物通過抑制芳香化酶,使雌激素水平下降,從而消除雌激素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的刺激作用[11]。其他臨床研究證實(shí)CYP19A1的基因多態(tài)性對(duì)阿那曲唑治療乳腺癌有著重要的影響[12];本研究基于生物信息學(xué)分析了CYP19A1在不同組織(正?；蚰[瘤)、癌癥分期、患者年齡、癌癥亞類和絕經(jīng)狀況的差異表達(dá),結(jié)果表明,阿那曲唑靶基因CYP19A1表達(dá)水平與ER+BRCA患者的生存具有顯著相關(guān)(P<0.05)。

CYP19A基因位于染色體15q21.1上,編碼細(xì)胞色素P450超家族成員,催化雌激素生物合成的最后一步,即雄激素A環(huán)的連續(xù)三次羥基化。癌癥基因組圖譜(TCGA)項(xiàng)目的基因組學(xué)數(shù)據(jù)促進(jìn)了多種腫瘤的基因差異表達(dá)和生存關(guān)聯(lián)的研究。本研究通過公共數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)并分析了阿那曲唑潛在抑制乳腺癌的靶基因CYP19A1,篩選出5個(gè)CYP19A1最重要的關(guān)聯(lián)基因(FGF7、MMRN1、LYVE1、HBS1L和DGAT2),將基因表達(dá)數(shù)據(jù)與特定基因拷貝數(shù)變異(CNV)結(jié)合分析,可以進(jìn)一步提供這些基因在功能研究中的相關(guān)生物學(xué)信息。眾所周知,大多數(shù)腫瘤不是由單個(gè)基因的單一突變引起的,研究CYP19A1基因的關(guān)聯(lián)基因表達(dá)情況,有助于更精準(zhǔn)的進(jìn)行腫瘤分型與治療。例如,在本研究中,mRNA表達(dá)分析結(jié)果表明,CYP19A1、HBS1L基因在正常組織中高表達(dá),在腫瘤組織中低表達(dá)。此外,拷貝數(shù)變異(CNV)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的,是人類疾病的重要致病因素之一。研究表明[13],CYP19A1擴(kuò)增導(dǎo)致芳香酶活性增加和雌激素非依賴性ERα與靶基因的結(jié)合,導(dǎo)致CYP19A1 amp(擴(kuò)增)細(xì)胞對(duì)AI治療的敏感性降低。在本研究中,CNV分析結(jié)果表明,乳腺癌中上述基因的主要突變類型為雜合擴(kuò)增和雜合缺失,雜合缺失比雜合擴(kuò)增更易引起基因變異;與其他基因相比,HBS1L基因表達(dá)水平與乳腺癌CNV改變的關(guān)聯(lián)更顯著。此外,通路富集結(jié)果顯示上述基因涉及重要的通路包括凋亡、細(xì)胞周期、激素受體等,進(jìn)一步揭示了CYP19A1基因畸變(或表達(dá))如何參與BRCA亞型患者生存的發(fā)病機(jī)制。在腫瘤發(fā)生過程中,miRNA可以通過自身的上調(diào)和下調(diào)分別行使原癌基因和抑癌基因的作用;miRNA也可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞抑制劑的敏感性。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中miRNA的復(fù)雜調(diào)節(jié)可以通過miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及miR-429)實(shí)現(xiàn)[14]。通過本研究預(yù)測(cè),miR-200、miR-300、miR-500家族涉及CYP19A1及相關(guān)基因的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),值得進(jìn)一步研究。

識(shí)別BRCA亞型的特異性生物標(biāo)志物是非常重要的。在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中,TCGA-BRCA腫瘤亞類分為L(zhǎng)uminal型、HER2陽性型以及三陰性型,特定基因CYP19A1的表達(dá)水平在這些組中分別顯示。本研究通過比較TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中996例CYP19A1突變組、CYP19A1未突變組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)果表明,CYP19A1在Luminal型、HER2陽性或三陰性乳腺癌中的表達(dá)存在顯著差異,提示絕經(jīng)后乳腺癌患者樣本中CYP19A1的表達(dá)可能比絕經(jīng)前患者更高。此外,其他生物信息學(xué)分析結(jié)果表明[15],CYP19A1基因的遺傳多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女芳香化酶活性和循環(huán)類固醇激素水平有關(guān)。候選基因研究[16]發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)前和絕經(jīng)后女性以及男性的雌激素水平與CYP19A1的基因變異有關(guān)。Friesenhengst等[17]分析了138例BRCA患者和15個(gè)乳腺癌細(xì)胞系腫瘤內(nèi)CYP19A1 mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在ER+BRCA患者中,CYP19A1的高表達(dá)與總生存率(OS)、無病生存率(DFS)、無轉(zhuǎn)移生存率(MFS)密切相關(guān),與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外,CYP19A1 mRNA在絕經(jīng)后和50歲以上患者中均顯著升高,且與ER類型和ESR1mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。其他證據(jù)顯示[18],CYP19A1基因表達(dá)水平的改變可能與疾病的病理臨床因素、OS、DFS、MFS、代謝功能標(biāo)志物、卵泡刺激素(FSH)濃度以及BRCA中CYP19A1基因的多個(gè)外顯子有關(guān)。這些研究結(jié)果突出了CYP19A1作為芳香化酶在ER+BRCA生物學(xué)中的關(guān)鍵作用。

綜上所述,本研究應(yīng)用cBioPortal、GSCALite和UALCAN等生物信息學(xué)工具分析了阿那曲唑的靶基因CYP19A1及其臨床意義,初步構(gòu)建了藥物-作用靶基因的關(guān)聯(lián)分析方法,為分析阿那曲唑甚至其他抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制提供參考。