焦占江 周杰

【摘 要】目的 探究干預(yù)RAAS系統(tǒng)的不同環(huán)節(jié)對(duì)大鼠肝組織中腫瘤壞死因子-α的影響。方法 選取50只SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組以及3個(gè)治療組（卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組），每組10只。對(duì)照組腹壁皮下注射橄欖油，其余組別的大鼠給予40% CCL4腹壁皮下注射；第2天開(kāi)始，3個(gè)治療組分別給予卡托普利60 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、螺內(nèi)酯100 mg/kg治療，模型組與對(duì)照組給予等量的生理鹽水，1次/d，第8周處死，取材后，通過(guò)Real Time-PCR檢測(cè)大鼠肝組織腫瘤壞死因子-αmRNA表達(dá)；病理染色，觀察大鼠肝組織的病理學(xué)改變。結(jié)果 3個(gè)治療組的肝纖維面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3個(gè)治療組大鼠的肝纖維面積與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組、3個(gè)治療組的大鼠肝纖維面積均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3個(gè)治療組肝組織中TNF-α mRNA的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；3個(gè)治療組肝臟組織中TNF-α mRNA的表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組、3個(gè)治療組肝臟組織TNF-α mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 干預(yù)RAAS系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)均可抑制肝纖維化形成，可能與抑制腫瘤壞死因子-α的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】RAAS系統(tǒng)；肝纖維化；腫瘤壞死因子-α

中圖分類號(hào)：R575 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-4949（2023）05-0028-04

Expression of Tumour Necrosis Factor-α in Hepatic Fibrosis of Rats After Local Blockage of Renin-angiptensin-aldosterone System at Different Links

JIAO Zhan-jiang1， ZHOU Jie2

（1.Department of General Surgery， the Second Peoples Hospital of Liaocheng， Liaocheng 252000， Shandong， China； 2.Department of Hepatobiliary Surgery， the Southern Hospital， the Southern Medical College， Guangzhou 510515， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To observe the effects on the expression of tumour necrosis factor-α in hepatic fibrosis of rats after intervention of the renin-angiotensin-aldosterone system at different links. Methods Fifty SD rats were randomly divided into control group， model group and three treatment groups （captopril group， losartan group and spironolactone group）， with 10 rats in each group. The rats in the control group were subcutaneously injected with olive oil， and the rats in the other groups were subcutaneously injected with 40% CCL4. From the second day， the three treatment groups were treated with captopril 60 mg/kg， losartan 10 mg/kg and spironolactone 100 mg/kg， respectively， and the model group and the control group were given the same amount of normal saline， once a day. The rats were sacrificed at the 8th week， and the expression of tumor necrosis factor-α mRNA in rat liver tissue was detected by RealTime-PCR. Pathological staining was used to observe the pathological changes of rat liver tissue. Results There was significant difference in liver fiber area among the three treatment groups （P<0.05）. There were significant differences in liver fiber area between the three treatment groups and the model group （P<0.05）. The liver fiber area of rats in the control group and the three treatment groups was lower than that in the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the expression of TNF-α mRNA in liver tissue among the three treatment groups （P>0.05）. The expression of TNF-α mRNA in liver tissue of the three treatment groups was lower than that of the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of TNF-α mRNA in the liver tissue of the model group and the three treatment groups was higher than that of the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Intervention in different links of RAAS system can inhibit the formation of hepatic fibrosis， which may be related to the inhibition of tumor necrosis factor-α expression.

【Key words】Renin-angiotensin-aldosterone system； Hepatic fibrosis； Tumour necrosis factor-α

臨床中自身免疫性疾病、脂肪肝、病毒感染、過(guò)度飲酒等因素均可導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。肝纖維化（hepatic fibrosis）是人體肝臟對(duì)各種慢性損傷的病理性修復(fù)反應(yīng)，其能夠進(jìn)一步導(dǎo)致纖維結(jié)締組織異常增生，肝纖維化處于早期時(shí)，是可以逆轉(zhuǎn)的，但是如果在肝纖維化早期時(shí)未及時(shí)加以阻斷，會(huì)進(jìn)一步發(fā)展可引起肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞結(jié)節(jié)性再生，發(fā)展為肝硬化，這時(shí)候的病理改變不可逆，會(huì)嚴(yán)重危害到患者的生命安全[1，2]。TNF-α在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[3]。RAAS為一內(nèi)分泌系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。肝纖維化的發(fā)展與RAAS系統(tǒng)密切相關(guān)[4-6]。盡管RAAS系統(tǒng)在肝病中的機(jī)制還沒(méi)有完全闡明，但這提示RAAS可能為抗肝纖維化治療的潛在靶點(diǎn)?；诖?，本研究通過(guò)干預(yù)RAAS不同環(huán)節(jié)對(duì)大鼠肝纖維化腫瘤壞死因子-α的影響，旨在為抗肝纖維化的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取6周SD大鼠50只，體重180～220 g，購(gòu)買于福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證編號(hào)為：SCXK（閩）2012-0001，常溫常濕環(huán)境飼養(yǎng)。二抗購(gòu)自Cellsignaling公司，TNF-α抗體、β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物的分組、模型的制備及用藥 50只大鼠按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為模型組、對(duì)照組以及3個(gè)治療組，各10只。對(duì)照組大鼠皮下注射橄欖油，3 ml/kg；其余大鼠在腹壁皮下注射40%CCl4，3 ml/kg，首劑量要加倍，建立大鼠肝纖維化模型，每3 d注射1次；第2天起，3個(gè)治療組開(kāi)始用藥，分別予以螺內(nèi)酯100 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、卡托普利60 mg/kg，用10 ml的生理鹽水稀釋后灌胃；對(duì)照組和模型組給予10 ml生理鹽水1次/d灌胃，在第8周時(shí)，處死所有大鼠，取材備測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo) ①一般情況：比如飲食、活動(dòng)、體重、精神等；②大鼠肝組織病理學(xué)觀察：大鼠的肝組織固定，包埋，切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色；大鼠肝組織Masson染色后，每張病理切片選擇肝臟組織四周及中央?yún)^(qū)域，并選取膠原纖維含量最多的視野，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，記錄著色的面積和總面積，在100倍鏡下測(cè)定肝臟組織膠原纖維面積百分比，計(jì)算方法為：膠原纖維面積/肝組織面積×100%；采用肝纖維化半定量計(jì)分系統(tǒng)（semi-quantitative scoring，SSS）進(jìn)行評(píng)分。

1.4 Realtime PCR的檢測(cè) 100 mg肝組織標(biāo)本，用TRIzol法抽提組織總RNA。將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。引物由Invitrogen公司合成。序列是：TNF-α（148 bp）上游：5CTGGCCAATGGCATGGATCTCAAA3；下游：5ATGAAATGGCAAATCGGCTGACGG3；Real-Time PCR反應(yīng)：根據(jù)引物序列設(shè)置擴(kuò)增程序，94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、72 ℃ 10 min；共40個(gè)循環(huán)。在200 μl的滅菌離心管中加入（25 μl反應(yīng)體系）：模板cDNA 0.5 μl ；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；SYBR green supermix，12.5 μl；去離子水11 μl，將離心管放入PCR擴(kuò)增儀，按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增；數(shù)據(jù)采用儀器ABI Prism 7300 SDS Software的軟件分析，基因的表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x-±s）表示，組間比較行F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察 各組大鼠均無(wú)死亡，模型組的大鼠精神不振，活動(dòng)減少，對(duì)外界的反應(yīng)變遲鈍，進(jìn)食和飲水變的減少，大鼠體重下降明顯；對(duì)照組各項(xiàng)活動(dòng)均正常，體重增加；3個(gè)治療組的大鼠精神、活動(dòng)、反應(yīng)、飲食、體重與模型組比較，均比較好。

2.2 各組肝組織病理變化比較 肝組織Masson染色，對(duì)照組大鼠肝組織中，可以看到膠原纖維只是在血管周圍有少量的表達(dá)，模型組大鼠肝組織中纖維有明顯的增生，形成了纖維間隔，有的區(qū)域形成了假小葉；3個(gè)治療組大鼠肝組織中膠原纖維減少，纖維間隔以及假小葉減少。HE染色見(jiàn)對(duì)照組大鼠的肝組織中，肝細(xì)胞以肝臟的中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，且肝臟組織結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肝組織中，肝細(xì)胞排列紊亂，有的肝細(xì)胞甚至呈脂肪變性，匯管區(qū)增大，在部分肝組織中，匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)還能夠見(jiàn)到浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞，甚至可以見(jiàn)到肝臟組織中有假小葉；3個(gè)治療組大鼠肝組織中可以見(jiàn)到肝細(xì)胞壞死減少，空泡變性減少。

2.3 各組大鼠肝纖維化半定量評(píng)分比較 3個(gè)治療組大鼠肝纖維化評(píng)分低于模型組（P =0.000、0.000、0.000）；3個(gè)治療組間大鼠肝纖維化評(píng)分相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000、0.980）；對(duì)照組、3個(gè)治療組大鼠肝纖維化評(píng)分低于模型組（P=0.000、0.000、0.000），見(jiàn)表1。

2.4 各組大鼠肝纖維面積比較 3個(gè)治療組的肝纖維面積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.779、0.422）；對(duì)照組、3個(gè)治療組肝纖維面積均低于模型組（P=0.000），見(jiàn)表2。

2.5 各組大鼠肝臟TNF-α表達(dá)情況比較 RealtimePCR結(jié)果分析顯示，3個(gè)治療組間TNF-αmRNA的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.663、0.082）；3個(gè)治療組TNF-αmRNA表達(dá)均低于模型組（P=0.000）；模型組、3個(gè)治療組TNF-αmRNA的表達(dá)高于對(duì)照組（P=0.000），見(jiàn)表3。

3 討論

肝纖維化是人體肝臟組織對(duì)損傷的愈合修復(fù)反應(yīng)[7]。研究表明[10]，各種各樣的因素導(dǎo)致慢性肝病在發(fā)展過(guò)程伴有肝纖維化的發(fā)生，肝纖維化早期的時(shí)候如不能得到有效控制，可能會(huì)發(fā)展為肝硬化，肝癌[8，9]。研究表明[11，12]，大部分肝纖維化患者治療后肝纖維化可逆轉(zhuǎn)至正常。肝臟纖維化是肝臟中的細(xì)胞外基質(zhì)增生和降解平衡被打破，從而造成肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積、肝臟結(jié)構(gòu)和功能改變的結(jié)果。以往認(rèn)為RAAS是人體一個(gè)內(nèi)分泌系統(tǒng)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[13]，它與肝纖維化的形成有密切關(guān)系，它的激活是肝纖維化形成的重要病理機(jī)制。TNF-α是一種與內(nèi)毒素?zé)o關(guān)的、可引起腫瘤出血壞死的活性分子。TNF-α在肝纖維化的產(chǎn)生及發(fā)展中起著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)[14]，TNF-α刺激肝臟星狀細(xì)胞后，可讓它的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)發(fā)生相關(guān)的改變，可讓它轉(zhuǎn)化為成為纖維細(xì)胞，儲(chǔ)脂能力喪失，并且表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其激活效應(yīng)反而增加。在正常情況下，肝組織中不表達(dá)或微量表達(dá)TNF-α，當(dāng)受到損傷因素刺激時(shí)，大量的TNF-α被釋放出來(lái)，參與肝損傷過(guò)程，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[15]。研究表明[16]，肝組織局部炎癥反應(yīng)時(shí)，TNF-α等炎癥因子大量釋放，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖、分化，使HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN等細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，間接引起纖維化形成。有研究表明[17]，有一部分中藥提取物，可能有抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制可能與降低血清中TNF-α等細(xì)胞因子水平有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，采用Real time PCR對(duì)大鼠的肝臟組織TNF-αmRNA進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)治療組大鼠肝組織中TNF-αmRNA的表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；3個(gè)治療組大鼠肝組織中的TNF-αmRNA表達(dá)卻低于模型組，差異有顯著意義（P<0.01）；模型組、3個(gè)治療組大鼠肝組織中的TNF-αmRNA表達(dá)高于對(duì)照組，差異有顯著意義（P<0.01），說(shuō)明干預(yù)于RAAS的不同環(huán)節(jié)均能夠減弱大鼠肝纖維化中TNF-αmRNA的表達(dá)。

此外，本研究通過(guò)CCL4建立的大鼠肝纖維化模型，病理學(xué)結(jié)果顯示，3個(gè)治療組大鼠較模型組大鼠的肝纖維化程度減輕，提示干預(yù)RAAS不同環(huán)節(jié)對(duì)大鼠肝纖維化具有比較好的抑制作用。Realtime PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟組織TNF-α的表達(dá)增強(qiáng)，但3個(gè)治療組肝臟組織TNF-α的表達(dá)減弱。

綜上所述，干預(yù)RAAS不同的環(huán)節(jié)對(duì)大鼠肝纖維化的作用機(jī)制可能和TNF-α的表達(dá)減弱有關(guān)系。

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編輯 柴泛宇