鄭世仲，周子維，陳曉慧，蔡烈偉，江勝滔，劉盛榮

拮抗炭疽病的茶樹內(nèi)生菌篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

鄭世仲，周子維，陳曉慧，蔡烈偉，江勝滔，劉盛榮*

寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100

為篩選高效拮抗茶樹炭疽病的內(nèi)生細(xì)菌，以茶樹健康葉片為材料，采用平板對(duì)峙拮抗法進(jìn)行篩選，并對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行鑒定、抑菌效果評(píng)價(jià)及培養(yǎng)條件優(yōu)化。從分離的162株內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株對(duì)茶樹膠孢炭疽菌有較好抑制效果的拮抗細(xì)菌X13。形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及16?S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析顯示，分離的菌株X13為枯草芽孢桿菌（）。菌株X13對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為61.6%。生長(zhǎng)曲線表明，菌株X13對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為接種后2～14?h。響應(yīng)面優(yōu)化的培養(yǎng)條件為4.0%（質(zhì)量百分濃度）玉米粉，1.0%（質(zhì)量百分濃度）的硝酸鈉，接種量3.5%（體積分?jǐn)?shù)）。本研究結(jié)果可為茶樹炭疽病防治及生防菌劑的開發(fā)提供重要參考。

茶樹；炭疽?。粌?nèi)生細(xì)菌；枯草芽孢桿菌；培養(yǎng)條件

茶樹（）屬山茶科山茶屬的常綠雙子葉木本植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。炭疽病是茶樹葉部的主要病害之一[1-2]，且在福建省等濕熱地區(qū)最容易發(fā)生和流行。茶炭疽菌病（Miyake）是由茶刺盤孢等炭疽菌屬真菌引起的。茶炭疽菌屬半知菌亞門、黑盤孢目、盤長(zhǎng)孢屬，膠孢炭疽菌（）為茶樹常見的一種炭疽病病原菌[3-4]。茶炭疽菌主要為害茶樹葉片，從葉尖或葉緣開始發(fā)病，開始呈水漬狀淺綠色，逐漸增大，形成形狀不規(guī)則的大病斑，中后期引起大量葉片脫落，影響茶樹生長(zhǎng)，造成茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量下降，給茶園造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，危害茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展[5-7]。

植物病蟲害的防治主要有物理、化學(xué)和生物防治3種方法，但化學(xué)防治會(huì)引起環(huán)境污染和農(nóng)殘等問(wèn)題。微生物制劑等生物防治法具有對(duì)人畜無(wú)毒、不污染環(huán)境和持效性長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已受到廣泛重視和開發(fā)利用，大量研究表明，利用拮抗微生物制備生防菌劑防治茶樹等植物病害具有很大潛力[6,8-10]。

拮抗微生物主要通過(guò)土壤或植物體進(jìn)行分離篩選，土壤篩選的拮抗菌多為產(chǎn)抗生素的放線菌[11-12]。內(nèi)生細(xì)菌是植物內(nèi)生菌群的重要組成，通過(guò)不同方式長(zhǎng)期定殖寄生在植物體內(nèi)，與寄主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)抵御病害又起重要作用，因此，植物內(nèi)生菌成為開發(fā)微生物農(nóng)藥防治植物病害的重要途徑。植物內(nèi)生菌的抑菌機(jī)理主要表現(xiàn)為合成水解酶、抗生素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等次生代謝物質(zhì)，殺死或抑制病原菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物體自身抵抗力，或誘導(dǎo)植物免疫應(yīng)答等途徑來(lái)抑制病原菌生長(zhǎng)，降低病原菌的侵染效率和致病性，而內(nèi)生菌自身又對(duì)寄主植物生長(zhǎng)沒(méi)有危害甚至有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用[13]。植物內(nèi)生細(xì)菌在茶樹、油茶和花卉果樹等植物生長(zhǎng)過(guò)程的生理作用和病害防治中的作用已經(jīng)被逐步發(fā)掘[14-16]。

茶樹炭疽病病征主要表現(xiàn)在成葉，其危害在很多茶區(qū)沒(méi)有引起足夠重視，但茶樹炭疽病的發(fā)生，不但影響茶樹生長(zhǎng)，甚至可能誘導(dǎo)茶樹次生代謝物質(zhì)發(fā)生變化，結(jié)果影響茶葉產(chǎn)量與品質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)茶樹炭疽病開展了廣泛研究，但主要針對(duì)炭疽病病原，而病害的生物防治研究較少。本研究以茶樹分離到的膠孢炭疽菌為病原指標(biāo)菌，從茶樹葉片分離篩選對(duì)茶炭疽病病原菌具有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)分離到的拮抗菌進(jìn)行鑒定和抑菌效果評(píng)價(jià)，優(yōu)化培養(yǎng)條件，為開發(fā)茶樹炭疽病生防菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試炭疽病病原菌膠孢炭疽菌，為發(fā)生炭疽病病害的茶樹葉片分離得到，保存于閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心微生物研究室；健康茶樹葉片從茶樹種植基地（福建寧德）采集，作為內(nèi)生細(xì)菌分離材料；基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，其組成按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為葡萄糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，KH2PO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·H2O 0.01%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，CaCl20.15%配制，調(diào)pH值至7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離

取茶樹成熟的健康葉片5.0?g，用70%乙醇溶液漂洗2～3次，10%的NaClO浸泡5?min，無(wú)菌水漂洗4～5次，晾干，50?mL無(wú)菌水研磨。研磨液稀釋至10-4倍，吸取0.1?mL稀釋液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，涂布，37?℃倒置培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單菌落，進(jìn)一步劃線純化、保種。

1.2.2 拮抗菌篩選

初篩，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法。PDA平板中心位置接種茶樹膠孢炭疽菌菌餅（直徑7.0?mm），周圍10.0?mm等距離接種分離的細(xì)菌，以僅接種茶樹膠孢炭疽菌菌餅為對(duì)照，25?℃恒溫箱培養(yǎng)。對(duì)照長(zhǎng)至培養(yǎng)皿近邊緣時(shí)，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率=（對(duì)照炭疽菌菌落直徑－處理直徑）/對(duì)照炭疽菌菌落直徑×100%。

復(fù)篩，采用瓊脂擴(kuò)散法。膠孢炭疽菌在PDA平板25?℃培養(yǎng)5?d，無(wú)菌水洗滌，制備1×105CFU·mL-1孢子懸液，取100?μL孢子懸浮液涂布PDA平板，每平板上放置3個(gè)牛津杯，加入150?μL初篩菌株發(fā)酵濾液，以無(wú)菌水為對(duì)照，培養(yǎng)4?d，觀察抑菌情況和測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.3 拮抗菌的鑒定

形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]。顯微鏡觀察形態(tài)，測(cè)試硝酸鹽還原、吲哚試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵等生理生化特性，對(duì)篩選的拮抗細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

16?S rDNA序列鑒定。EasyPure Genomic DNA Kit（全式金生物科技公司）基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，微量核酸檢測(cè)儀（Thermo Scientific）檢測(cè)DNA濃度和純度；引物27F/1492R（27F：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′）擴(kuò)增16?S rDNA序列，PCR反應(yīng)體系25?μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5?℃預(yù)變性5?min；95?℃變性30?s，60?℃退火30?s，72?℃延伸90?s，35個(gè)循環(huán)；72?℃延伸10?min。EasyPure? Quick Gel Extraction Kit（全式金生物科技公司）膠回收試劑盒純化回收后克隆，陽(yáng)性克隆子送華大基因測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST同源性序列比對(duì)分析，并從中下載相似度較高的序列，用MEGA 7.0軟件（Neighbor-Joining，NJ鄰位相連法）構(gòu)建分子系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。

1.2.4 種子液制備

將活化后的分離菌株X13刮取1環(huán)接入50?mL滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯（250?mL三角瓶），37?℃搖床200?r min-1培養(yǎng)20?h，即為液體種子液。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

種子液按3.0%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入裝有50?mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250?mL三角瓶，搖床培養(yǎng)條件200?r·min-1和37?℃，每2?h取培養(yǎng)液。以滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，3個(gè)平行培養(yǎng)作為重復(fù)。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）單因素試驗(yàn)：碳源篩選，供試碳源為可溶性淀粉、大豆粕、麩皮、甘露醇、蔗糖和玉米粉，按2.0%（質(zhì)量百分濃度）添加量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，3.0%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入X13種子液。發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)的裝液量為250?mL三角瓶裝50?mL培養(yǎng)基，37?℃、200?r·min-1搖床培養(yǎng)，14?h后測(cè)試發(fā)酵液OD600值，篩選出最適碳源。設(shè)置最佳碳源濃度范圍為1.0%～5.0%，采用相同方法確定適宜的濃度。每次試驗(yàn)3個(gè)獨(dú)立的平行培養(yǎng)作為重復(fù)。

氮源篩選，大豆粕、硫酸銨、硝酸鈉、尿素作為氮源，添加量2.0%（質(zhì)量百分濃度），代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他條件同上，確定最適氮源及合適濃度。

接種量確定，以最適碳源、氮源及濃度配制培養(yǎng)基，按2.0%、3.0%、4.0%、5%和6.0%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種，其他條件同上，確定合適的接種量。

（2）Box-Behnken試驗(yàn)：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)基礎(chǔ)上，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0軟件。玉米粉濃度（A）、硝酸鈉濃度（B）和接種量（C）3個(gè)因素為自變量，菌體生長(zhǎng)量OD600值為響應(yīng)值進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素及水平見表1。

以O(shè)D600值試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸分析，建立自變量與響應(yīng)值之間定量關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，值檢驗(yàn)評(píng)價(jià)模型的可靠性，相關(guān)系數(shù)（2）作為模型擬合程度的指標(biāo)，值小于0.05視為變量顯著。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或平均值（Box-Behnken試驗(yàn)）的形式表示。采用Excel 2007和Design-Expert 8.0進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)分析。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌篩選

從茶樹葉片共分離到162株具有不同形態(tài)的茶樹內(nèi)生細(xì)菌菌株，并進(jìn)一步初篩、復(fù)篩。其中，菌株X13對(duì)茶樹炭疽病病原菌抑制率和抑菌圈直徑最大，抑制率達(dá)到61.6%，抑菌圈直徑17.9?mm。因此，選擇X13菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。圖1為菌株X13與茶樹炭疽病病原菌的拮抗作用圖。

2.2 菌株X13的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

菌株X13菌落圓形，呈乳脂色，不透明，前期表面較光滑，后期有明顯褶皺，邊緣不整齊；革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體桿狀，有芽孢，無(wú)莢膜，周生鞭毛；好氧生長(zhǎng)，能利用葡萄糖、甘露醇和木糖發(fā)酵產(chǎn)酸，可水解明膠，能利用檸檬酸鹽，能分解色氨酸形成吲哚，硝酸鹽反應(yīng)和V-P檢測(cè)陽(yáng)性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步確定X13菌株為芽孢桿菌屬。

2.2.2 16?S rDNA鑒定

菌株X13的16?S rDNA序列長(zhǎng)度1?449?bp，序列已提交保存于GenBank，NCBI登錄號(hào)OP420513.1?；?6?S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹見圖2。由圖2可知，X13菌株和枯草芽孢桿菌（）YL1在進(jìn)化樹的同一分支，且根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，X13菌株與YL1的16?S rDNA序列相似度為99.72%，因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定結(jié)果，確定分離的菌株X13為枯草芽孢桿菌。

注：A為試驗(yàn)組，B為對(duì)照組

圖2 枯草芽孢桿菌X13系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 菌株X13的生長(zhǎng)曲線

菌株X13在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線如圖3所示，菌株的延滯期為2?h，2～14?h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14～24?h處于穩(wěn)定期，24?h后開始進(jìn)入衰亡期。說(shuō)明菌株X13生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)旺盛，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不嚴(yán)格，易培養(yǎng)。發(fā)酵接種時(shí)，種子液以培養(yǎng)10～14?h為宜，此時(shí)活性高、繁殖能力強(qiáng)，且活菌數(shù)高。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 不同碳源和氮源對(duì)菌株X13生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，在供試的6種碳源中，以玉米粉作為碳源時(shí)穩(wěn)定期的菌體生長(zhǎng)量最大（圖4A）；隨玉米粉添加量不斷增加，菌體生長(zhǎng)量呈先增加后降低的趨勢(shì)；添加量為4.0%時(shí)，菌株X13生長(zhǎng)量最高（圖4B）。因此，玉米粉為X13菌株的最適碳源，添加量為4.0%。

圖3 菌株X13生長(zhǎng)曲線

由圖4C和圖4D可以看出，硝酸鈉（NaNO3）作為氮源時(shí)，穩(wěn)定期X13菌株生長(zhǎng)量最高。不同NaNO3添加量對(duì)X13菌株生長(zhǎng)有明顯的影響，菌體生長(zhǎng)量隨NaNO3添加量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，NaNO3添加量為1.0%時(shí)，X13菌株生長(zhǎng)量達(dá)到最大值。因此，NaNO3為最適氮源，添加量為1.0%。

2.4.2 不同接種量對(duì)枯草芽孢桿菌X13菌株生長(zhǎng)影響

由圖5可知，接種量對(duì)X13菌株生長(zhǎng)有一定的影響，接種量為3.0%時(shí)，X13菌株生長(zhǎng)量達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加接種量，生長(zhǎng)量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，因此，最佳接種量為3.0%。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及回歸模型建立

Box-Behnken試驗(yàn)共有17組試驗(yàn)組合，試驗(yàn)結(jié)果見表2。以O(shè)D600為響應(yīng)值（），利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量回歸擬合，建立的回歸方程為：=-14.7+4.47+8.53+3.21-0.22+0.15-0.47-0.592-3.232-0.502

模型回歸方程的方差分析結(jié)果見表3，模型的F值為26.45，Prob>F值<0.01，表明模型極顯著，可用于分析和預(yù)測(cè)不同培養(yǎng)條件下的菌體生長(zhǎng)，失擬項(xiàng)值為0.188?6，不顯著，表明模型與純誤差無(wú)關(guān)，模型可靠。模型的相關(guān)系數(shù)2=0.971?4，表明回歸方程擬合度高，響應(yīng)值的97.14%可由模型變量解釋。

注：A，碳源；B，玉米粉添加量；C，氮源；D，硝酸鈉添加量

圖5 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌X13菌株生長(zhǎng)影響

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

注：**表示差異極顯著（<0.01）；*表示差異顯著（<0.05）

Note: ** means highly significant difference (<0.01). * means significant difference (<0.05)

自變量A、B和C 3個(gè)因素對(duì)OD600值有極顯著影響（<0.001），交互項(xiàng)BC的影響為顯著（<0.05），平方項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)結(jié)果有極顯著影響（<0.001）。各因素對(duì)菌體生長(zhǎng)影響大小為B（NaNO3添加量）>A（玉米粉添加量）>C（接種量）。

2.5.2 因素交互作用分析

回歸模型的響應(yīng)面曲面圖和等高線圖如圖6所示。由圖6A和圖6B可以看出，接種量為3.0%時(shí)，OD600值隨玉米粉添加量增加呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)，硝酸鈉添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響同玉米粉相近，因此，兩個(gè)因素均在0水平附近有最大的菌體生長(zhǎng)量。兩者間的等高線圖呈圓型，表明兩者間無(wú)顯著的相互作用。

圖6C和圖6D為玉米粉與接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)影響的響應(yīng)面和等高線圖，可以看出，變量NaNO3添加量固定為1.0%，OD600值隨接種量的增加呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)，接種量為3.0%時(shí)達(dá)到最大；玉米粉添加量約4.0%時(shí)菌體生長(zhǎng)達(dá)到最大，低于或高于該水平時(shí)，生長(zhǎng)量下降。等高線圖顯示兩因素間無(wú)顯著相互作用。

接種量和NaNO3添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見圖6E和圖6F，自變量玉米粉濃度固定為4.0%。接種量增加可提高菌體生長(zhǎng)量，高于3.3%開始下降；OD600值隨NaNO3的添加量增加先增加而后減小。等高線圖呈橢圓型，表明兩者間有顯著的相互作用。

軟件優(yōu)化的各因素最佳組合為玉米粉添加量4.06%，硝酸鈉添加量0.94%，接種量3.35%，模型預(yù)測(cè)的OD600最大值為3.76。

注：A和B分別表示玉米粉添加量與硝酸鈉添加量交互作用的曲面圖和等高線圖；C、D分別表示玉米粉添加量與接種量交互作用的曲面圖和等高線圖；E、F分別表示硝酸鈉添加量與接種量交互作用的曲面圖和等高線圖

2.6 回歸模型的試驗(yàn)驗(yàn)證

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)?？紤]操作的方便性，將響應(yīng)面優(yōu)化的條件略作改進(jìn)，即玉米粉添加量4.0%，硝酸鈉添加量1.0%，接種量3.5%，3個(gè)重復(fù)。驗(yàn)證試驗(yàn)的OD600平均值為3.78，與模型的預(yù)測(cè)值3.76非常接近，證實(shí)所建立的模型可靠，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)不同條件下菌株X13的生長(zhǎng)。

3 討論

植物發(fā)生的病害種類很多，引起的原因并不相同。迄今為止，使用化學(xué)合成農(nóng)藥仍是防治植物病害的主要措施，但伴隨引起的農(nóng)殘超標(biāo)和環(huán)境污染問(wèn)題日益凸顯。目前，安全高效的生物防治植物病害已經(jīng)引起廣泛重視，已開發(fā)出多種生物防治菌劑。已有報(bào)道表明，生防菌主要從土壤或植物根際進(jìn)行分離篩選，大多數(shù)屬放線菌和真菌，但土壤來(lái)源的微生物很難在植物體或植物表面對(duì)習(xí)居微生物獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，從而影響防治效果，限制了生防菌劑的推廣應(yīng)用[18-19]。值得指出的是，由于細(xì)菌繁殖速度快，易人工培養(yǎng)，且營(yíng)養(yǎng)要求低，生產(chǎn)成本低，因此，植物內(nèi)生細(xì)菌可作為防治植物病害的重要天然資源，具有潛在研究?jī)r(jià)值和開發(fā)前景。

植物內(nèi)生細(xì)菌分布于植物的不同組織，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中已適應(yīng)宿主植物體的體內(nèi)生態(tài)環(huán)境，也能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，作為外源菌劑噴施于宿主植物，能快速適應(yīng)宿主環(huán)境，易于植物附生和獨(dú)立寄生繁殖，占據(jù)有利生態(tài)位，容易直接對(duì)病原菌發(fā)起攻擊，分泌拮抗物質(zhì)抑制或殺死病原菌，發(fā)揮生防作用，而植物自身的遺傳特性和生長(zhǎng)均不會(huì)受到影響[20-22]。已有的研究表明，利用茶樹內(nèi)生細(xì)菌開發(fā)的生防菌劑能最大程度發(fā)揮菌劑的生防作用，不僅能夠高效抑制病原菌對(duì)茶樹的病害，還可提高茶樹的抗逆性，促進(jìn)茶樹生長(zhǎng)[23-24]。

植物內(nèi)生細(xì)菌種類繁多，其中芽孢桿菌屬能產(chǎn)芽孢，對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，是生防菌的重要來(lái)源，能通過(guò)分泌抗菌物質(zhì)或者誘發(fā)植物自身的抗病潛能從而增加植物抗病性[25-26]。本研究從健康葉片中分離到1株對(duì)茶樹膠孢炭疽菌有較強(qiáng)拮抗作用的茶樹內(nèi)生細(xì)菌X13，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及16?S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析顯示分離的菌株X13為枯草芽孢桿菌。

本研究所分離到的菌株X13生長(zhǎng)繁殖速度快，營(yíng)養(yǎng)要求低，易培養(yǎng)。采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌X13的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為玉米粉添加量4.0%、硝酸鈉添加量1.0%、接種量3.5%，該工藝發(fā)酵成本較低；從平板拮抗試驗(yàn)可知，菌株X13對(duì)茶樹炭疽病病原菌抑制率達(dá)到61.6%，與陳百文等[27]及代亞鋒等[28]分離得到的一些拮抗菌相比，具有更高的抑制率，且發(fā)酵粗提液也具有較好的抑菌作用。因此，菌株X13具有大規(guī)模開發(fā)為低成本生防菌劑的潛力，可用于茶樹炭疽病的安全高效防治。

拮抗菌的生防機(jī)制主要表現(xiàn)為與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)以及生長(zhǎng)空間，或合成胞外水解酶以及一些抑菌的次生代謝產(chǎn)物。本研究主要開展了拮抗炭疽病的茶樹內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，已有的研究表明，產(chǎn)生各種水解酶是芽孢桿菌起抑菌作用的一種重要方式[29-30]，菌株X13也屬芽孢桿菌，是否與其他芽孢桿菌有相同抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究，包括真菌細(xì)胞壁水解酶產(chǎn)生、抑菌成分分離鑒定及對(duì)病原菌的菌絲和孢子生長(zhǎng)的影響，以及與宿主茶樹之間的互作關(guān)系。

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Screening, Identification and Culture Condition Optimization of Antagonistic Endophytic Bacteria AgainstMiyake

ZHENG Shizhong, ZHOU Ziwei, CHEN Xiaohui, CAI Liewei, JIANG Shengtao, LIU Shengrong*

College of Life Sciences College, Ningde Normal University, Ningde 352100, China

To screen the antagonistic endophytic bacteria againstMiyake, the healthy leaves of tea plants were utilized as materials, and the plate antagonistic method was used. The isolated bacteria were identified and evaluated for antimicrobial efficacy. The culture conditions were optimized using response surface methodology. One antagonistic bacterium X13 was screened from 162 strains of endophytic bacteria isolated, which had a good inhibitory effect on. The strain X13 was identified asthrough morphological observation, physiological and biochemical tests, and 16S rDNA phylogenetic analysis. Theinhibitory rate of strain X13 on the mycelial growth ofreached 61.6%. Thelogarithmic growth was between 2-14?h. The optimal culture conditions were 4.0% (masspercentage concentration) corn flour, 1.0% (mass percentageconcentration) NaNO3, and 3.5% (volume fraction) inoculation. This study laid a key theoretical foundation for the prevention of the tea pathogenand the development of its biocontrol agents.

tea plant,, endophytic bacteria,, culture condition

S517.1；S435.711

A

1000-369X（2023）02-205-11

2022-09-18

2022-12-06

福建省自然科學(xué)基金（2020J01425）、寧德師范學(xué)院校級(jí)中青年項(xiàng)目（2020Q101）、寧德師范學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目（2020Y013）

鄭世仲，男，副教授，主要從事微生物生化和園藝生物技術(shù)研究。*通信作者：fjhost@163.com