陳振艷，張相琴，陳蘭，謝思藝，劉碩謙,2*，田娜,2*

茶樹基因家族的鑒定及表達分析

陳振艷1，張相琴1，陳蘭1，謝思藝1，劉碩謙1,2*，田娜1,2*

1. 湖南農業(yè)大學園藝學院茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南農業(yè)大學園藝學院茶學系，湖南 長沙 410128

NUDIX水解酶屬于焦磷酸酶，在信息傳遞、植物生長協(xié)調和響應逆境脅迫等方面起著重要作用?；诓铇洌ǎ┗蚪M鑒定出43個家族基因，并運用生物信息學和實時熒光定量PCR等方法對其分析。結果表明，43個CsNUDXs蛋白質分子量介于11.8～89.2?kDa，氨基酸長度為102～342個，理論等電點為4.49～9.26，18.6%的蛋白為穩(wěn)定性蛋白；根據(jù)進化關系將分為6個亞家族；啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)具有許多與激素響應、逆境脅迫和生長發(fā)育等調控相關的作用元件；對家族基因在不同器官表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)、在果實中表達量較高，而、在果實中表達量極低，在老葉中表達量極低；不同處理組的實時熒光定量PCR結果表明，1?mmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）處理下、和等表達量呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢，而1?mmol·L-1水楊酸（SA）處理下、和等表達量則呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢，300?mmol·L-1NaCl處理下和等表達量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。本研究應用生物信息學技術初步解析了的基本特征和功能，發(fā)現(xiàn)可響應高鹽脅迫和MeJA、SA處理。

茶樹；基因家族；非生物脅迫；表達分析

NUDIX水解酶（Nucleoside diphosphate linked to x hydrolases）是一類能夠催化水解核苷糖、二核苷多聚磷酸鹽和三磷酸核苷等多類有機焦磷酸鹽的焦磷酸酶[1]，廣泛分布在生物體內。大腸桿菌中MutT（NudA）是最早被發(fā)現(xiàn)的NUDIX水解酶，故NUDIX水解酶家族又被稱為MutT家族[2]。該家族特征是具有一段高度保守的氨基酸序列——GX5EX7REUXEEXGU（其中U表示疏水基團，X表示任意氨基酸），當其核心序列REUXEEX中的谷氨酰胺殘基與二價陽離子結合時，NUDIX蛋白發(fā)揮作用[2-3]。

NUDIX水解酶在植物逆境脅迫響應過程中發(fā)揮著重要作用。干旱脅迫下，過表達山桃（）可提高、和等抗性基因的表達，有效減少煙草的干旱損傷[4]；敲除擬南芥（）中的基因會降低其抗氧化脅迫能力[5]，當被沉默后會誘導防御相關基因的表達，并提高植物對丁香假胞菌的抗性[6]；過表達可維持植物體內正常的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）含量，增強植物抗氧化脅迫的能力[5,7]。此外，NUDIX水解酶也廣泛參與了植物激素信號的轉導過程。對山桃苗進行脫落酸（Abscisicacid，ABA）處理后，會受到明顯誘導，且轉基因煙草中的和等ABA信號通路中關鍵基因的轉錄水平明顯高于野生型（WT），而的轉錄水平明顯低于WT，表明可調控ABA信號轉導通路[4]；是NPR1依水楊酸（Salicylic acid，SA）信號通路的陽性調節(jié)因子，敲除或過表達會使參與SA誘導NPR1激活過程中相關基因和的表達量增加或降低[4,8]；與野生型相比，和基因共缺失型擬南芥的差異基因對茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）的響應顯著[9]。目前，家族已經在擬南芥[10]、陸地棉（）[11]、桃樹（）[4]、玫瑰（）[12]、甘菊（）[13]、大豆（）[14]和葡萄（）[15]等植物中被鑒定，其在擬南芥中響應植物激素和逆境脅迫的作用機制已逐漸被揭開，但在茶樹中的研究尚淺[16]。

因此本研究基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫，對茶樹家族基因進行全基因組鑒定，并分析茶樹基因家族成員在不同器官及高鹽脅迫和激素處理（MeJA和SA）下的表達模式，為進一步探究家族基因在茶樹中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以碧香早茶樹枝梢為試驗材料，采自湖南農業(yè)大學茶葉研究所茶園（113° E，28° N）。

高鹽處理：將長勢一致且生長狀況良好的茶樹枝梢插入300?mmol·L-1NaCl溶液中。激素處理：向茶樹枝梢分別噴灑1?mmol·L-1MeJA溶液和1?mmol·L-1SA溶液，以液體布滿葉片為標準；并將插入ddH2O中的茶樹枝梢作為對照。將以上處理材料放入溫度為(25±2)℃、相對濕度為70%～75%、光照周期為14?h光/10?h暗的氣候室中進行培養(yǎng)。在處理0、3、9、24?h和48?h后隨機摘取3～5片嫩葉，取樣后進行液氮冷凍固樣，置于–80?℃保存?zhèn)溆?，每個處理3次生物學重復。

1.2 試驗方法

1.2.1基因家族的篩選

從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫（http://teaplant.org/index.html）中下載茶樹的全基因組數(shù)據(jù)，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https://www. arabidopsis.org）中下載擬南芥NUDIX蛋白序列，用于后續(xù)分析。以擬南芥的25個NUDIX蛋白序列為參考，在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中進行BlastP比對，設定閾值E<1E-6，獲得潛在的基因家族序列；從PFAM（http://pfam. xfam.org）數(shù)據(jù)庫中下載NUDIX基因特有的保守結構域模型（PF00293），并通過HMMER 3.0軟件中的hmmersearch搜索鑒定含有NUDIX保守結構域的茶樹蛋白序列。合并已獲得的兩個推定的蛋白序列文件，提交至SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）、PFAM和NCBI-CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）等網(wǎng)站進行驗證，整理并剔除冗余序列，獲得最終的茶樹NUDIX基因家族成員。

1.2.2 CsNUDXs蛋白理化性質及亞細胞定位預測

利用ExPASy Compute pI/Mw（http://web. expasy.org/compute_pi）對NUDIX蛋白的理化性質進行分析，用WoLF PSORT（https://wolfpsort. hgc.jp）工具預測蛋白質亞細胞定位。

1.2.3系統(tǒng)發(fā)育關系、基因結構和基序分析

通過MEGA 7.0軟件對茶樹和擬南芥的NUDIX蛋白序列進行多序列比對，并采用鄰近連接法（Neighbour-joining method）構建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)設置為1?000次[17]。將家族基因的編碼序列（Coding sequence，CDS）提交至MEME網(wǎng)站（https:// meme-suite.org）進行基因基序分析，基序數(shù)目設置為10個，氨基酸長度設置為6～55個，其余參數(shù)為默認。通過TBtools[18]軟件進行可視化分析。

1.2.4染色體定位和啟動子順式元件分析

利用HMMER 3.0軟件中的perl腳本從茶樹基因組注釋信息中獲取在染色體上的起始位置，并通過MG2C（http://mg2c. iask.in/mg2c_v2.1）進行可視化。運用TBtools軟件提取上游2?000?bp的序列，通過PlantCare（http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare）網(wǎng)站進行啟動子順式作用元件預測，并通過TBtools[18]軟件進行可視化。

1.2.5表達模式分析

從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中下載茶樹8個不同器官（頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、莖、根、花和果實）中的表達量數(shù)據(jù)，篩選高表達的家族成員，并通過TBtools[18]軟件進行可視化。

1.2.6 實時熒光定量PCR分析

利用FastPure?Universal Plant Total RNA Isolation Kit（諾唯贊，南京）分別提取對照組和3個處理組（NaCl、MeJA和SA）的茶樹嫩葉總RNA，并通過超微量紫外分光光度計（賽默飛，美國）和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性、純度和濃度。使用Fastking gDNA Dispelling RT SuperMix Kit（天根，北京）將RNA反轉錄為cDNA。

2 結果與分析

2.1 CsNUDXs基因家族的篩選及理化性質

從茶樹基因組中共鑒定到43個基因，根據(jù)其在染色體上的位置進行命名，并進一步對其編碼的蛋白質進行理化性質分析。結果表明，茶樹NUDIX含有氨基酸殘基為102～342個；分子量為11.8～89.2?kDa；脂肪族指數(shù)為50.67～103.67；理論等電點（pI）介于4.49～9.26，其中pI＜7的CsNUDXs蛋白達到70%以上。43個CsNUDXs蛋白中僅有CsNUDX1、CsNUDX3、CsNUDX6、CsNUDX10、CsNUDX21、CsNUDX22、CsNUDX30和CsNUDX31的不穩(wěn)定指數(shù)低于40，其余均為不穩(wěn)定蛋白。除CsNUDX36和CsNUDX29外，其余CsNUDIXs蛋白均為親水性蛋白。亞細胞定位預測結果顯示（表2），主要分布在細胞核、葉綠體、線粒體中。

2.2 CsNUDXs系統(tǒng)進化

將茶樹和擬南芥的基因家族成員構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果表明（圖1），茶樹基因家族可分為6個亞家族，分別含有10、3、10、8、3個和9個。其中（CSS0008608.1）和（CSS0042662.1）、（CSS0021705.1）和（CSS0015340.1）等26個基因在進化樹上分別成對出現(xiàn)，說明它們進化關系較近；（CSS0000911.1）、（CSS0028900.1）、（CSS0035220.1）、（CSS0026873.1）和（CSS0026618.1）等5個與進化關系較近。

表1 CsNUDXs表達分析的實時熒光定量PCR引物

表2 CsNUDXs的亞細胞定位

2.3 CsNUDXs結構和基序分析

對43個的保守基序進行分析，共鑒定出10個保守基序，依次命名為motif 1 ～motif 10（圖2）。所包含的基序數(shù)量介于1～6，其中motif 1出現(xiàn)最頻繁，其次是motif 10、motif 7和motif 6。均含有motif 1，motif 10為亞家族Ⅰ和亞家族Ⅵ共有；此外，motif 2、motif 5和motif 8僅存在于亞家族Ⅲ中，motif 3、motif 4和motif 9僅存在于亞家族Ⅵ中。

對6個亞家族的的結構分析發(fā)現(xiàn)（圖3），亞家族Ⅰ中內含子數(shù)目為1～7，其中和內含子數(shù)目最多，為7個；亞家族Ⅱ中的含有20個內含子，和各有5個內含子；亞家族Ⅲ中除（4個內含子）和（5個內含子）外，其余基因均有3個內含子；亞家族Ⅳ的內含子數(shù)目為3～5，、和均有3個內含子；亞家族Ⅴ中和有7個內含子，僅有4個內含子；亞家族Ⅵ的內含子數(shù)目為5～8。綜上所述，各亞家族中內含子數(shù)量差異較大，但同一亞家族中內含子個數(shù)相同的基因結構更為相似。

2.4 CsNUDXs染色體分布和啟動子順式作用元件分析

染色體分布結果顯示（圖4），有39個不均勻的分布在Chr1、Chr2、Chr4、Chr5、Chr6、Chr7、Chr8、Chr10、Chr12、Chr14和Chr15號染色體上。其中Chr12號染色體有6個，Chr6和Chr8號染色體各有5個，Chr1、Chr2、Chr5和Chr7號染色體各有4個，Chr14號染色體有3個，Chr10號染色體有2個，Chr4和Chr15號染色體各有1個；、、、這4個基因未定位在染色體上。

圖1 茶樹和擬南芥NUDIX基因家族的系統(tǒng)進化樹

圖2 茶樹NUDIX基因的motif分析

圖3 茶樹NUDIX基因結構分析

對上游2?000?bp的啟動子區(qū)域進行順式作用元件分析，結果顯示（圖5），除了含有基礎的作用元件外（如和轉錄相關的TATA-box、CAAT-box等），還含有與光響應、激素響應、逆境脅迫和生長發(fā)育調控等相關的順式作用元件。

2.5 CsNUDXs在茶樹不同器官的表達分析

在不同器官表達模式分析結果顯示（圖6），在頂芽中表達量較高的基因有和，嫩葉中表達量較高的基因有、和，成熟葉中表達量較高的基因有、、和，老葉中表達量較高的基因有和，莖中表達量較高的基因有、和，根中表達量較高的基因有、、和等，花中表達量較高的基因有、和，、和在果實中表達量較高；此外，和在果實中表達量極低，在老葉中表達量極低，這表明在茶樹不同器官中具有表達特異性。

圖4 茶樹NUDIX基因在茶樹染色體上的定位

注：A表示光響應，B表示脫落酸響應，C表示損傷響應，D表示低溫響應，E表示赤霉素響應，F(xiàn)表示胚乳特異性負表達，G表示水楊酸響應，H表示干旱反應，I表示激素響應，J表示類黃酮合成基因調控，K表示玉米醇溶蛋白代謝調節(jié)，L表示種子特異性調節(jié)，M表示分生組織表達，N表示逆境脅迫，O表示缺氧反應，P表示厭氧反應，Q表示茉莉酸甲酯響應

2.6 CsNUDXs在MeJA、SA及NaCl處理下的表達模式

篩選出、、和等9個在茶樹不同器官中表達量較高且含有大量與激素響應或非生物脅迫相關元件的基因做進一步的驗證。

由圖7可知，在MeJA處理下，、、和的表達量較高，的表達量持續(xù)上升，其余基因在處理后的表達量均呈先上升后下降再上升的趨勢。

在SA處理下（圖8），和的表達量在0～9?h下降，9～24?h上升，然后繼續(xù)呈下降趨勢；和的表達量在處理0～3?h后下降，3～24?h上升，然后呈下降趨勢；和的表達量在處理0～3?h上升，3～9?h下降，9～24?h上升，然后繼續(xù)下降趨勢，其中表達量較高。

在NaCl處理下（圖9），和的表達量較高。其中，和的表達量在處理后0～3?h增加，之后呈下降趨勢；的表達量在處理后0～3?h和9～24?h上升，3～9?h和24?h之后呈下降趨勢；在處理后0～3?h增加，3～9?h下降，之后呈上升趨勢。

3 討論

NUDIX水解酶可以降解植物體內積累過多的有害代謝物，在信息傳遞、生長協(xié)調和機體保護等方面起著重要作用[20]。本研究基于茶樹全基因組數(shù)據(jù)共鑒定出43個茶樹基因。在分析43個茶樹基因保守基序時發(fā)現(xiàn)，每個基因中包含的基序數(shù)量在1～6，且進化關系較近的在基序的種類和長度上都較相似，這可能是由于同一亞家族的基因在功能選擇和長期進化下形成的[21]；其中，motif 1為各共有，表明它可能承擔著重要且相似的功能；motif 10為亞家族Ⅰ和亞家族Ⅵ共有，推測亞家族Ⅰ和亞家族Ⅵ的行使的功能可能有交叉。真核生物基因組的復雜程度與內含子數(shù)量有關[22]，基因間內含子數(shù)目差異易導致形成不同的可變剪切體，基因組中的可變剪切體可增強茶樹對非生物脅迫的抗逆能力[23]；本研究發(fā)現(xiàn)大部分家族基因的內含子數(shù)目介于1～20，且6個亞家族間存在差異（Ⅰ類：1～7，Ⅱ類：5～20，Ⅲ、Ⅳ類：3～5，Ⅴ類：4～7，Ⅵ類：5～8），家族基因的內含子數(shù)目差異可能導致形成不同的可變剪切體進而增強茶樹的抗逆能力。在鹽脅迫環(huán)境中，過量的Na+取代植物生長必需的K+，且Na+、Cl-與蛋白質或氨基酸結合時會降低蛋白質或氨基酸的活性，鹽脅迫引起的滲透脅迫和營養(yǎng)不協(xié)調進一步引起氧化脅迫，使植物的光合作用和呼吸作用的電子鏈發(fā)生斷裂，最終導致植物死亡[24]。研究發(fā)現(xiàn)，甘菊在NaCl澆灌處理后，在0～48?h的表達量先上升后下降，表明可響應鹽脅迫，可能通過降低超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性[25]、增加過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性以提升甘菊清除活性氧的能力，進而提升了甘菊適應鹽脅迫的能力[13]。茶樹在響應鹽脅迫時，表達量也呈先升后降的趨勢，因此推測可能通過清除茶樹體內的活性氧參與了茶樹響應鹽脅迫的過程。

注：AB表示頂芽，YL表示嫩葉，ML表示成熟葉，OL表示老葉，S表示莖，R表示根，F(xiàn)L表示花，F(xiàn)R表示果實

注：不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平差異顯著，下同

本研究還發(fā)現(xiàn)，在啟動子區(qū)富含激素響應相關的作用元件，表明可能通過多個順式作用元件參與茶樹對激素的響應過程。在SA處理下呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢，敲除或者過表達會使得參與到SA誘導NPR1激活過程中的相關基因和的表達量上升或下降，表明可正向調節(jié)SA誘導NPR1激活過程進而影響植物免疫反應[8]；甘菊的表達量在SA的誘導下也先上升后下降[13]。本研究發(fā)現(xiàn)和的表達量在SA處理后也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，這與和表達模式相同，說明和可能通過正向調節(jié)SA誘導NPR1激活過程參與茶樹對SA的響應。MeJA是植物體內重要的脂類衍生化合物，可作為信號分子和生長調節(jié)物質參與到植物的生長發(fā)育和對逆境脅迫的響應等過程[26]。MeJA可通過加深植物因鹽脅迫導致的生長抑制，降低6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）和赤霉素（Gibberellin，GA）等植物激素的轉錄水平，使植株能更有效地進行離子穩(wěn)態(tài)、滲透調節(jié)和抗氧化防御等反應[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MeJA處理下大部分的表達模式有差異，表明響應MeJA刺激的作用機制不同。

圖8 外源SA處理下部分CsNUDXs的相對表達量

圖9 外源NaCl處理下部分CsNUDXs的相對表達量

此外，NUDIX水解酶在植物生長過程中起著重要的協(xié)調作用[15]，亞細胞定位預測結果顯示主要分布在細胞核、葉綠體、線粒體中，這與大豆（）的結果一致[14]，說明可能在細胞核、葉綠體和線粒體中發(fā)揮作用。玫瑰在花瓣中表達量最高，且花發(fā)育后期香氣散發(fā)達到最大時表達量持續(xù)增加，而抑制的表達后玫瑰芳香物質合成減少[28]。玫瑰品種唐紅中的表達量與花朵開放程度呈正相關，且主要芳香成分也隨花朵開放程度增加而增加，在盛開期達到最高；將轉入矮牽牛（Vilm）中可顯著增加矮牽牛的主要香氣成分含量，且感官上可聞到濃郁香氣，過表達也可顯著增強矮牽牛花香的濃郁程度[29]。以上結果表明，家族基因的組織表達特異性與其功能具有較高的相關性。本研究發(fā)現(xiàn)，和在花中表達量較高而在其他組織部位中表達量極低，推測其主要在花中發(fā)揮作用。

本研究首次對全基因組進行了鑒定和表達模式分析，在43個的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了許多與光響應、激素響應和逆境脅迫相關的作用元件，且在茶樹各組織中均有表達，表明參與茶樹的生長發(fā)育調控。此外，利用實時熒光定量PCR技術檢測了9個在SA、MeJA和NaCl處理下的表達模式，發(fā)現(xiàn)其均可響應SA、MeJA和NaCl處理。綜上所述，可以響應多種逆境脅迫，但在協(xié)調茶樹生長發(fā)育和響應逆境脅迫過程中的具體機制仍需進一步探清。

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Identification and Expression Pattern Analysis ofGene Family in

CHEN Zhenyan1, ZHANG Xiangqin1, CHEN Lan1, XIE Siyi1, LIU Shuoqian1,2*, TIAN Na1,2*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. Department of tea science, College of horticulture, Hunan Agricultural university, Changsha 410128, China

NUDIX hydrolase belongs to pyrophosphatase, which plays an important role in information transmission, plant growth coordination and responses to adversity stresses. In this study, 43family genes were identified based on the tea () genome, and analyzed by bioinformatics and fluorescence quantitative PCR. The results show that the protein molecular weight of 43 CsNUDXs rang from 11.8～89.2?kDa, with 102 to 342 amino acids. The theoretical isoelectric point was from 4.49 to 9.26, and 18.6% of them were stable proteins. According to the evolutionary relationship,is divided into six subfamilies.-acting element analysis of promoter shows thathave many functional elements related to hormone response, adversity stress, growth and development. The expression patterns ofin different organs were analyzed. It was found that the expression levels ofandwere high in fruits, while the expression levels ofandwere extremely low in fruits, and the expression level ofwas extremely low in old leaves. In addition, the results of real-time fluorescence quantitative PCR show that the expression levels of, such as,andincreased first, then decreased and then increased under the treatment of 1?mmol·L-1MeJA. However, under the treatment of 1?mmol·L-1SA, the expression levels of,anddecreased first, then increased and then decreased. While under the treatment of 300?mmol·L-1NaCl, the expression levels of,andincreased first and then decreased. In summary, the basic characteristics and functions ofwere preliminarily analyzed by bioinformatics technology, and it was found thatcould respond to high salt stress, MeJA and SA treatments.

,gene family, abiotic stress, expression analysis

S571.1；Q786

A

1000-369X(2023)02-159-14

2023-01-17

2023-03-04

國家自然科學基金（32172629）、湖南省種業(yè)創(chuàng)新項目（2021NK1008）

陳振艷，女，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種及分子生物學方面研究。*通信作者：shuoqianliu@hunau.net；tianna5678@163.com