摘要 為探究DEHP對雌性動物肝臟毒性及肝損傷的作用，本試驗選取21 d的健康雌性小鼠80只，隨機分為對照組（玉米油，CK）、DEHP低劑量組［100 mg/（kg·d），LD］、DEHP中劑量組［250 mg/（kg·d），MD］及DEHP高劑量組［500 mg/（kg·d），HD］，將其分別溶解于0.3 mL玉米油中連續(xù)灌胃14 d。末次灌胃后禁食12 h，處死并取出肝臟組織進行HE染色和Nrf2免疫組織化學檢測。結果表明，DEHP處理的小鼠肝臟出現了肝水腫、細胞紊亂、壞死變性和炎癥等肝臟病理現象，呈現劑量越高損傷越嚴重的趨勢。IHC檢測發(fā)現Nrf2在MD和HD中的表達顯著高于CK（Plt;0.01）。DEHP暴露可能促使Nrf2過度表達，Nrf2的持續(xù)積累對肝臟細胞造成損傷及炎癥反應，從而誘導小鼠肝臟損傷。本研究為深入探討DEHP對動物肝臟的毒性作用機制提供參考。

關鍵詞 DEHP；Nrf2；小鼠；肝臟損傷；毒性影響

中圖分類號 X592 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）23-24-0066-05

DEHP promotes Nrf2 protein expression to induce liver injury in mice

XIAO Lilin " "MENG Jinzhu " "XIAO Hongbo*

（College of Veterinary Medicine， HunanAgricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract To explore the effect of DEHP on liver toxicity and liver injury in female animals， 80 healthy female mice for 21 d were selected and randomly divided into control （corn oil， CK）， low dose of DEHP [100 mg/（kg·d）， LD]， DEHP [250 mg/（kg·d）， MD] and high dose of DEHP [500 mg/（kg·d）， HD]， and were dissolved in 0.3 mL corn oil for 14 d. After the last gavage was fasted for 12 h， the liver tissue was sacrificed and removed for HE staining and Nrf2 immunohistochemical detection. It was found that the liver of DEHP treated mice showed liver pathological phenomena， such as liver edema， cellular disorder， necrosis and inflammation， and the higher the dose， the more severe the damage. Nrf2 expression was significantly higher in MD and HD than in CK （Plt;0.01）. DEHP exposure may promote the overexpression of Nrf2， and the continuous accumulation of Nrf2 causes damage and inflammatory response to liver cells， thus inducing liver damage in mice. It lays the foundation for further exploring the toxic mechanism of DEHP on animal liver.

Keywords DEHP; Nrf2; mice; liver injury; toxic effects

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[bis （2-ethylhexyl） phthalate，DEHP]是一種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境內分泌干擾物，被廣泛應用于醫(yī)療、器械、各類包裝和玩具等塑料制品中[1-2]，以改善塑料制品的柔韌性和耐用度[3-4]。DEHP以非共價鍵的方式與聚氯乙烯結合，極易從塑料制品中析出[5-6]，在水體、土壤和空氣等環(huán)境介質中長期存在[7-8]，最終通過食物鏈轉移到動物和人體中[9-10]。

DEHP可通過吸入、口服和皮膚接觸等方式進入人體，導致多方面的健康問題，如內分泌毒性、生殖系統(tǒng)疾病和非酒精性脂肪肝等生理性疾病[11-12]。近年來，多項研究在血液、尿液和唾液中檢測到DEHP及其代謝產物[13-14]，隨著環(huán)境檢出率和人群暴露水平的不斷提高，DEHP會影響到人體健康的各個方面，但其對機體健康的損害機制尚不清楚。

肝臟是代謝外源性和內源性物質的主要代謝器官，具有排毒、抗氧化、促進蛋白質合成和糖脂代謝等功能。過量攝入DEHP可能造成不同程度的肝損傷[15]。Nrf2蛋白在保護細胞免受氧化應激和其他損傷的過程中發(fā)揮重要作用[16]。因此，推測DEHP可能影響Nrf2蛋白表達進而引起肝臟損傷。本研究通過給予小鼠DEHP染毒，分析DEHP暴露對小鼠肝臟Nrf2蛋白表達的影響，探討DEHP對動物肝臟的毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取21 d健康雌性ICR小鼠80只［許可證號SCXK（湘）2019-0004］，體重20～23 g。小鼠生長環(huán)境保持溫度24～26 ℃，相對濕度45%～65%，光/暗循環(huán)為12 h，在試驗期間可自由攝食和飲水。

1.2 試劑和儀器

DEHP（國藥集團有限公司，中國）；蘇木素-伊紅染液（索萊寶，中國）；Nrf2兔單克隆抗體（博奧森，中國）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（愛博泰克，中國）；顯微鏡（奧林巴斯CX31，日本）；組織包埋機（常州市中威電子儀器有限公司BMJ-A，中國）；病理組織攤烤片機（常州市中威電子儀器有限公司PHY-III，中國）；石蠟組織切片機（萊卡，德國）。

1.3 試驗方法

按照隨機數字表法將小鼠分為4組，分別灌胃0（對照組，CK）、100 mg/（kg·d） DEHP（低劑量組，LD）、250 mg/（kg·d） DEHP（中劑量組，MD）及500 mg/（kg·d） DEHP（高劑量組，HD），將各處理DEHP分別溶解于0.3 mL玉米油中連續(xù)灌胃14 d。每日觀察小鼠狀態(tài)，于最后一次灌胃后禁食12 h，使用麻醉處死并記錄小鼠體重。75%乙醇擦拭小鼠胸腹部皮毛，用組織剪剪斷小鼠肋骨暴露出整個胸腔，用眼科剪剪斷肝門靜脈，使用尖鑷小心地將肝臟完整取出。剪取部分肝臟置于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.3.1 HE染色 "肝臟組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，60 ℃烘箱中烤片1.5 h。脫蠟過程：二甲苯I浸泡10 min→二甲苯II浸泡10 min→無水乙醇浸泡5 min→95%乙醇浸泡5 min→90%乙醇浸泡5 min→80%乙醇浸泡5 min→70%乙醇浸泡5 min→蒸餾水清洗3次。蘇木精染核：Harris蘇木素染色4 min，蒸餾水沖洗切面。切片放入1%鹽酸乙醇中浸泡1 min，用蒸餾水沖洗終止分化，直到切片變藍。伊紅染色：伊紅染色3 min，清水沖洗120 s。脫水和透明：依次將組織切片放在70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇和二甲苯中各浸泡3 min。封片，鏡檢。

1.3.2 免疫組織化學檢測 "將肝臟組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，60 ℃烘箱中烤片1.5 h。脫蠟過程：二甲苯I浸泡20 min→二甲苯Ⅱ浸泡20 min→無水乙醇浸泡5 min→75%乙醇浸泡5 min→蒸餾水浸泡5 min?？乖迯停?0 x EDTA稀釋成1 x，微波爐中火8 min→停火7 min→中火7 min，冷卻至室溫，PBS洗3次，各5 min。封閉：將組織圈住后，加入BSA，封閉50 min。孵一抗：加稀釋后的一抗4 ℃過夜。孵二抗：PBS洗3次，每次5 min，加二抗，室溫孵育50 min。DAB顯色：PBST洗3次，每次10 min（搖床搖），50 x DAB稀釋成1 x。蘇木素核染：蒸餾水沖洗1 min，蘇木素染1 min，蒸餾水沖洗1 min。分化+返藍：分化（75%乙醇 100 mL+1%鹽酸1 mL）2～5 s，蒸餾水沖洗，返藍10 s，蒸餾水沖洗。脫水封片：將切片分別經無水乙醇、75%乙醇脫水處理5 min，置于二甲苯中透明5 min。封片，鏡檢。

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS 27.0對所得數據進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析LSD檢驗；Plt;0.05為差異顯著，Plt;0.01為差異極顯著。用Image-pro plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA），并求出平均光密度值IOD/AREA。采用GraphPad Prism 8.0.2作圖。

2 結果與分析

2.1 DEHP對小鼠肝細胞Nrf2蛋白表達的影響

免疫組化結果如圖1所示，與對照組相比，DEHP干預后Nrf2蛋白表達水平均有不同程度的改變。由圖2可知，Nrf2蛋白表達水平與DEHP劑量呈正相關的關系。即DEHP劑量越高則肝臟損傷越嚴重，且MD250和HD500組中的Nrf2在肝細胞中的平均光密度較CK顯著增高（Plt;0.01），其他組無顯著性差異。

2.2 DEHP對小鼠肝臟組織形態(tài)學的影響

HE病理結果如圖3所示，CK肝結構正常，肝細胞排列有序，細胞輪廓清晰，未見明顯變性，肝竇未見擴張，組織未見明顯炎癥細胞浸潤；LD100 組肝損傷程度較對照組有所增加，肝細胞排列紊亂，部分肝細胞水腫，胞漿疏松，如圖3（B）箭頭f所示；小葉內可見少量炎癥細胞浸潤，如圖3（B）箭頭i所示；MD250組肝損傷程度較LD100組有所增加，肝竇廣泛輕度擴張，肝細胞排列紊亂，如圖3（C）箭頭m所示；小葉內可見多處炎癥細胞灶性浸潤，如圖3（C）箭頭n所示；HD500組肝損傷程度最重，肝細胞排列嚴重紊亂，部分細胞壞死變性，胞核碎裂或消失，只見紅色均染結構，如圖3（D）箭頭g所示；小葉內可見大量炎癥細胞灶性浸潤，如圖3（D）箭頭h所示。

3 結論與討論

DEHP作為環(huán)境污染物之一，其毒性對人類和動物健康會產生一些不利影響[3，12]，一些流行病學和動物研究證實了DEHP對肝臟的毒性[14，17]。Dong等[18]使大鼠暴露于DEHP中，發(fā)現肝臟組織病理學表現為局灶性壞死并伴有炎癥因子聚集以及空泡變性。為了更深入探究DEHP對肝臟病理的影響，本研究利用經口灌胃的方法使健康小鼠暴露于DEHP中，來觀察DEHP對小鼠肝臟毒性。多項研究表明[19-20]，在DEHP暴露下，大鼠肝臟中觀察到明顯的局灶性壞死和炎癥細胞浸潤等病理現象；經飼料摻入DEHP喂飼90 d，2 500 mg/（kg·bw） DEHP染毒組出現精神亢奮或萎靡、局部掉毛等中毒體征，病理結果顯示DEHP試驗組肝臟炎癥細胞增多、肝細胞脂肪病變，隨著DEHP劑量的升高，肝細胞進一步腫大、空泡以及變性壞死[21]。本試驗結果趨勢與相關研究結果相符，隨著劑量升高肝損傷逐漸加重，光學顯微鏡下觀察HE染色組織切片也證實了上述觀點，在本研究中，染毒組的肝臟表現出不同程度的病理變化。高劑量組小鼠肝組織中肝細胞排列嚴重紊亂、核溶解且小葉內大量炎癥細胞灶性浸潤，與相關研究報道一致，DEHP暴露會加速肝損傷、壞死[22]及纖維化[23]，且DEHP可導致肝腫大、炎性細胞浸潤、肝紊亂和擴張等肝臟結構變化[24]。這些結果表明，小劑量DEHP作用于小鼠后，隨著染毒劑量的不斷增大，先是出現部分肝細胞受損，其余肝細胞代償性增生，當毒性劑量超過肝臟代償能力時，可致使毒物代謝能力緩慢減弱，從而導致毒物在機體作用的時間進一步拉長[17]，對機體造成損傷。綜上，肝臟是DEHP發(fā)揮毒性作用的靶器官，DEHP暴露對肝臟能夠產生明顯的影響。但是DEHP對肝臟損害原因有待進一步研究。

研究表明，接觸DEHP可刺激機體產生大量活性氧（ROS），造成氧化損傷，進而激活多種信號通路，促進細胞凋亡，導致肝臟損傷[25-26]。本研究結果發(fā)現DEHP促Nrf2蛋白表達，Nrf2是一種重要的轉錄因子，與機體的抗氧化應答有關。研究表明，Nrf2蛋白被視為一個重要的藥物靶點，用于治療多種疾病[27]，當細胞受到氧化應激或其他刺激時，會導致Nrf2蛋白的積累和活化。高劑量DEHP暴露會過表達Nrf2，導致Nrf2的持續(xù)積累，阻斷Nrf2介導的氧化應激防御反應。Huang等[28]經口灌胃大鼠連續(xù)染毒28 d，發(fā)現ROS升高，肝臟血清丙二醛（MDA）的含量極顯著增高（Plt;0.01），引起大鼠體內的氧化應激，導致大鼠發(fā)生肝臟氧化損傷，且隨染毒劑量的加大和時間的拉長，毒性作用越明顯，各項指標差異呈現明顯的劑量—效應關系。Zhang等[29]黃卓權等[30]研究結果共同表明，DEHP暴露后肝臟中ROS和MDA含量顯著升高。DEHP通過促進小鼠肝臟中ROS的產生氧化應激從而誘導破壞肝細胞結構和導致肝功能受損，本研究也證明了這一結果。在本研究中，IHC染色結果顯示DEHP干預后Nrf2蛋白表達水平均有不同程度的改變。MD和HD組中的Nrf2蛋白表達較CK顯著增高（Plt;0.01），即肝臟損傷越嚴重，Nrf2蛋白表達水平越高。DEHP暴露會致使致Nrf2蛋白過度表達，從而導致氧化應激反應，促進細胞凋亡，使肝臟受到損傷，具體作用機制還需要進一步研究探討。

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（責編：李 媛）