摘要 對青海湖裸鯉（♀）×花斑裸鯉（♂）雜交卵的受精情況和胚胎發(fā)育過程進(jìn)行觀察，探索了二者雜交的可能，并介紹雜交胚胎發(fā)育過程。結(jié)果表明，青海湖裸鯉卵子和花斑裸鯉精子能完成受精，水溫15～17 ℃時(shí)受精率為92.5%。受精卵淡黃色，微黏，沉性。受精卵卵徑1.9～2.1 mm ，受精2～3 min后出現(xiàn)黏性，開始吸水后膨脹，吸水膨脹后卵徑3.5～4.1 mm。雜交胚胎發(fā)育過程分為受精、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成和孵化7個(gè)時(shí)期，受精3 h 20 min后進(jìn)入卵裂期，16 h 30 min后進(jìn)入囊胚期，30 h 20 min后進(jìn)入原腸期，39 h后進(jìn)入神經(jīng)胚期，42 h 50 min后進(jìn)入器官形成期，100 h 50 min后進(jìn)入孵化期。在水溫為15～17 ℃下，受精卵歷時(shí)136 h 30 min后全部完成出膜，胚胎畸形率1.67%。因此，青海湖裸鯉（♀）與花斑裸鯉（♂）能夠進(jìn)行雜交，雜交卵受精率、孵化率及畸形率與母本自交卵無顯著差異（Pgt;0.05）。

關(guān)鍵詞 青海湖裸鯉；花斑裸鯉；魚類雜交育種；魚類胚胎發(fā)育

中圖分類號 S961 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）23-24-0061-05

青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）是鯉科裂腹魚亞科裸鯉屬魚類，體側(cè)扁較長，俗稱湟魚，主要分布于高海拔地區(qū)的鹽堿水域青海湖水系，喜生活在海灘附近水流緩慢區(qū)，適應(yīng)力強(qiáng)，生長緩慢[1]。花斑裸鯉（Gymnocypris eckloni）俗稱大嘴花魚，也是鯉科裂腹魚亞科裸鯉屬魚類，個(gè)體較大，背部為青灰色或棕褐色，腹部淺黃色，主要分布在黃河上游水系和柴達(dá)木盆地格爾木河水系[2]。青海湖裸鯉長期生活在氣溫低、冰凍期長的高海拔湖區(qū)，生存環(huán)境較為惡劣，生長相對緩慢，一尾魚年增重約為50 g，體型較花斑裸鯉小[1，3]。

青海湖裸鯉和花斑裸鯉都具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如青海湖裸鯉嫩度大、系水力小、口感較佳，而花斑裸鯉蛋白質(zhì)和脂肪總量高于青海湖裸鯉，人工養(yǎng)殖的花斑裸鯉品質(zhì)佳，二者營養(yǎng)價(jià)值均較高，可提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[4]，目前不少地區(qū)開展了兩種裸鯉的人工繁殖和養(yǎng)殖研究[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)，花斑裸鯉對小瓜蟲的抗病力較強(qiáng)[10-11]。青海湖裸鯉為雜食偏肉食性魚類，消化糖類和脂肪的能力較強(qiáng)，而花斑裸鯉對蛋白質(zhì)的消化能力更強(qiáng)[8，12]?；ò呗沲幊谒鬏^緩的底層區(qū)域并有捕食其他魚類的習(xí)性，其嗅覺也強(qiáng)于青海湖裸鯉[13]。

本試驗(yàn)以青海湖裸鯉為母本，花斑裸鯉為父本進(jìn)行人工雜交，并對受精卵發(fā)育進(jìn)行觀察，探討二者雜交的可行性，以期獲得性狀優(yōu)良的雜交種，提升裸鯉屬魚類經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為裸鯉屬魚類雜交育種和生產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年4月在四川涼山彝族自治州喜德縣進(jìn)行，試驗(yàn)所用親本魚均由該地區(qū)正源水產(chǎn)有限公司裂腹魚類繁育基地提供，取性成熟青海湖裸鯉雌魚24尾，花斑裸鯉、青海湖裸鯉雄魚各12尾，雌雄配比1∶1進(jìn)行人工授精，獲得雜交和自交受精卵各約5萬粒，將獲得的受精卵作為胚胎發(fā)育觀察的材料。受精卵置于避光環(huán)境下微流水孵化，孵化水溫15～17 ℃，每天用濃度0.3%的高錳酸鉀溶液浸泡受精卵1 min進(jìn)行消毒，及時(shí)清除孵化器內(nèi)的死卵，保持水質(zhì)清新、水流暢通。

1.2 試驗(yàn)方法

魚類胚胎各階段發(fā)育速度不同，根據(jù)同亞科或同屬魚類胚胎發(fā)育各階段相關(guān)研究的描述確定觀察頻率[14-16]：受精0～2 h內(nèi)，每10 min觀察一次；受精2～8 h內(nèi)，每20 min觀察一次；受精8～13 h內(nèi)，每30 min觀察一次；受精13～33 h內(nèi)，每1 h觀察一次；受精33～81 h內(nèi)，每2 h觀察一次；受精81～129 h內(nèi)，每6 h觀察一次；受精129～250 h內(nèi)，每12 h觀察一次；至破膜前每天隨機(jī)觀察5次。隨機(jī)取受精卵100粒，在解剖鏡下觀察其發(fā)育情況，當(dāng)2/3的胚胎發(fā)育到某一時(shí)期則認(rèn)為胚胎已發(fā)育到此時(shí)期，記錄此時(shí)期胚胎發(fā)育時(shí)間和特征[16-19]。

受精后30 min待雜交卵受精膜舉起后統(tǒng)計(jì)受精率，隨機(jī)取100粒卵，計(jì)數(shù)受精卵數(shù)，重復(fù)計(jì)3次，計(jì)算受精率；出膜前隨機(jī)取100粒受精卵，觀察胚胎存活情況和發(fā)育情況，重復(fù)計(jì)3次，計(jì)算孵化率，記錄胚胎異常發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)畸形率。

試驗(yàn)過程中同步觀察、統(tǒng)計(jì)青海湖裸鯉自交卵的受精情況和胚胎發(fā)育情況，并與之進(jìn)行比較。

1.3 數(shù)據(jù)分析

觀察并記錄受精、孵化和畸形狀況，用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，分析雜交卵與青海湖裸鯉自交卵受精率、孵化率和畸形率的差異，用P值和平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示結(jié)果，顯著水平α取0.05時(shí)，Plt;0.01時(shí)差異極顯著，Plt;0.05時(shí)差異顯著，Pgt;0.05時(shí)差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎發(fā)育基本情況

雜交受精卵為沉性卵，淡黃色，圓球狀，卵徑1.9～2.1 mm，卵質(zhì)透明，外被薄而光滑卵膜。在水溫15～17 ℃下，受精1～2 min后吸水膨脹至3.5～4.1 mm，受精2～3min后出現(xiàn)黏性并黏附于孵化器壁上，3 min后沉于水底。雜交卵與青海湖裸鯉自交卵性質(zhì)相同，受精與孵化情況比較見表1。由表1可知，雜交卵與青海湖裸鯉自交卵卵徑大小相當(dāng)，為1.9～2.2 mm，均為圓球形微黏沉性卵，卵黃顆粒均勻、無皸裂。在相同孵化條件下雜交胚胎孵化時(shí)間136 h 30 min，與自交胚胎孵化時(shí)間相當(dāng)（137 h）。雜交后代與青海湖裸鯉自交后代受精率受精率均大于90%，孵化率大于85%，畸形率小于3%，二者受精率、孵化率和畸形率差異均不顯著（Pgt;0.05）。

2.2 雜交胚胎發(fā)育過程

根據(jù)雜交胚胎的發(fā)育特點(diǎn)，可將胚胎發(fā)育過程分為7個(gè)時(shí)期，分別為受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、器官形成期和孵化期。

2.2.1 受精卵期 "如圖1a所示，受精卵圓球形淡黃色，卵徑1.9～2.1 mm，受精1～2 min后迅速吸水可膨大1.6～2.0 mm。受精2 h后，卵黃慢慢變成橢圓形并開始下沉，卵周間隙明顯，原生質(zhì)緩慢流向動(dòng)物極，約10 min后在此形成胚盤，如圖1b所示。

2.2.2 卵裂期 "受精后3 h 20 min，分裂溝出現(xiàn)，隨著胚盤緩慢膨脹和分裂溝加深，胚盤細(xì)胞被一分為二，進(jìn)入2細(xì)胞期，如圖1c所示。受精后4 h 10 min，細(xì)胞繼續(xù)分裂，縱裂溝出現(xiàn)并將細(xì)胞割裂成4個(gè)大小相等的細(xì)胞，為4細(xì)胞期，如圖1d所示。受精后4 h 50 min，胚盤被分裂成2排4列8個(gè)細(xì)胞，此為8細(xì)胞期，如圖1e所示。受精后5 h 30 min，形成l6個(gè)細(xì)胞，此為16細(xì)胞期，如圖1f所示。受精后7 h 50 min，形成32個(gè)細(xì)胞，為32細(xì)胞期，如圖1g所示。受精后13 h，細(xì)胞分裂速率不同步，細(xì)胞大小不等，數(shù)量較多，在卵黃囊上聚集形成桑椹胚，進(jìn)入多細(xì)胞期，如圖1h所示。

2.2.3 囊胚期 "受精后16 h 30 min，卵黃囊上出現(xiàn)明顯的細(xì)胞團(tuán)，形成囊胚，進(jìn)入囊胚初期，如

圖1i所示。受精后19 h，細(xì)胞數(shù)量顯著增加，此時(shí)囊胚突起至最高，步入囊胚中期階段，如圖1j所示。受精后24 h 50 min，囊胚細(xì)胞往邊緣展開覆蓋在卵黃上，細(xì)胞界限變得模糊，囊胚邊緣慢慢變薄逐漸下包，步入囊胚晚期，如圖1k所示。

2.2.4 原腸期 "受精后30 h 20 min，囊胚細(xì)胞植物極下方包裹至1/3，進(jìn)入原腸早期，如圖1l所示。受精后33 h，胚盤細(xì)胞繼續(xù)向下包裹，動(dòng)植物極的直徑逐漸拉長，卵黃被包裹至1/2時(shí)，與卵黃相接處的細(xì)胞突出可見胚環(huán)和胚盾，此為原腸中期，如圖1m所示。至受精后36 h 50 min，卵黃被包裹超過 3/4，為原腸晚期，如圖1n所示。

2.2.5 神經(jīng)胚期 "受精后39 h，細(xì)胞下包至底部 5/6處，卵黃末被包住部分露出卵黃栓，胚體形成，輪廓清晰，神經(jīng)板內(nèi)陷形成神經(jīng)溝1o所示。30 min后，卵黃栓變小，胚孔封閉，如圖1p所示。

2.2.6 器官形成期 "受精后42 h 50 min，胚體中間出現(xiàn)體節(jié)，胚體兩側(cè)微微突出，可分辨頭尾，為體節(jié)出現(xiàn)期，如圖1q所示。受精后63 h 20 min，體節(jié)增多后端形成尾芽，為尾芽期，如圖1r所示。尾芽快速伸長，牽拉卵黃囊向后延伸成棒狀，尾端與腹部明顯分離，胚體演變成“蝌蚪”狀。受精后75 h 20 min，肌節(jié)漸漸收縮，背部肌節(jié)輕輕抽動(dòng)（3～4次/min），緩慢向尾部伸長，步入肌肉效應(yīng)期，如圖1s所示。受精后90 h 50 min，眼囊下方的透明凹陷處可見心臟并開始搏動(dòng)，進(jìn)入心跳期，如圖1t所示。尾部末端兩側(cè)有膜狀突起，為尾鰭褶，胚體在膜內(nèi)擺動(dòng)頻率快，尾部帶動(dòng)胚體在轉(zhuǎn)動(dòng)[10]。

2.2.7 孵化期 "受精后100 h 50 min，進(jìn)入出膜前期，如圖1u所示。受精后113 h 20 min，胚體不斷進(jìn)行擺尾，進(jìn)入出膜期（圖1v）。此后，卵膜變軟，為戳破卵膜，出膜前胚體會(huì)不斷翻轉(zhuǎn)和旋轉(zhuǎn)、強(qiáng)擺尾速度和力度，最后胚體在不停擺動(dòng)中破膜彈出。約23 h后，出膜全部完成可見初孵仔魚（圖1w）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中雜交卵受精率高，雜交胚胎發(fā)育正常，孵化率較高，畸形率低，與青海湖裸鯉自交卵之間無顯著差異，說明青海湖裸鯉卵子和花斑裸鯉精子具有相容性，青海湖裸鯉（♀）和花斑裸鯉（♂）可以進(jìn)行雜交，也側(cè)面印證了青海湖裸鯉與黃河的花斑裸鯉可能為近緣種關(guān)系這一觀點(diǎn)[20]。

魚類的胚胎發(fā)育狀況受溫度影響較大[21]，溫度升高發(fā)育時(shí)間縮短[22-23]，如青海湖裸鯉在13.5～18 ℃水溫條件下138 h左右完成孵出，孵化水溫保持在17～19 ℃時(shí)孵化時(shí)間為120 h左右[24]；花斑裸鯉在16 ℃水溫條件下150 h 45 min左右完成孵化，水溫19 ℃時(shí)113 h 50 min孵出，水溫28 ℃時(shí)，不能正常孵出[19]。本研究中青海湖裸鯉（♀）×花斑裸鯉（♂）雜交胚胎在15～17 ℃的水溫下孵化，136 h 30 min后仔魚孵出，與母本自交胚胎發(fā)育時(shí)間（137 h）相當(dāng)。魚卵大小對早期胚胎發(fā)育速率有一定影響，魚卵越大，卵黃為胚胎提供的營養(yǎng)物質(zhì)越多，相應(yīng)會(huì)降低胚胎發(fā)育速率，延長胚胎發(fā)育時(shí)間，提高胚胎存活率[25-27]。本研究中雜交卵大小與母本青海湖裸鯉卵大小相同，小于父本花斑裸鯉卵（2.1～2.6 mm），其胚胎發(fā)育時(shí)間也表現(xiàn)出與母本相同而短于父本的特點(diǎn)。

隨著青海湖裸鯉和花斑裸鯉野生種質(zhì)資源的日漸珍貴，開展不同裸鯉的雜交研究，是加強(qiáng)裸鯉野生種質(zhì)資源保護(hù)的重要途徑之一。青海湖裸鯉和花斑裸鯉可以進(jìn)行雜交，具有孵化率高、畸形率低的優(yōu)勢，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并在物種多樣性保護(hù)中具有一定意義。

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（責(zé)編：張 蓓）