鄧 娟，左右清，王 念，胡熙苒，曾 禮

（1 湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床學(xué)院，湖南 411104；2 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)損傷是當(dāng)前研究的熱點,其前提和關(guān)鍵是優(yōu)化種子細胞的選取,骨髓基質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）則是一種比較理想的種子細胞來源[1-2]。FRIEDENSTENI 通過培養(yǎng)骨髓液發(fā)現(xiàn)貼壁生長的細胞,隨著傳代次數(shù)的增加,細胞越來越均勻,呈形態(tài)一致的長形或長梭形[3]。全骨髓培養(yǎng)法操作相對簡單,對設(shè)備要求不高,且細胞活性好[4]。因此本實驗采集SD 大鼠股骨骨髓液,采用全骨髓培養(yǎng)方法培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞,流式細胞儀檢測BMSCs 表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD45,鑒定骨髓基質(zhì)干細胞的純度。

1 試劑與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 4 周齡SD 健康大鼠,體重180～200 g（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物中心提供）,L-DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO 公司）,胎牛血清（FBS,Hyclone 公司）,FITC anti-rat CD29 及同型陰性對照、FITC anti-rat CD45 及同型陰性對照（Biolegend 公司）,FITC anti-rat CD34 及同型陰性對照（北京博奧森公司）。

1.2 骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng) 取SD 大鼠1 只,乙醚麻醉,75%酒精中浸泡7～10 min。無菌條件下取雙側(cè)股骨,剪斷兩端,注射器吸取含10%胎牛血清L-DMEM 培養(yǎng)基5 mL 沖洗骨髓腔獲得骨髓液,吸管反復(fù)吹打,制成單細胞懸液。分種在4 瓶50 mL 塑料培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于24 h、48 h 半量換液,注意不要搖晃,72 h時全量換液,換液時輕輕震蕩培養(yǎng)瓶,倒出舊液,以去掉非貼壁細胞,之后每3 天換液1 次。待細胞融合鋪滿瓶底80%以上,用0.25%胰蛋白酶消化,以1∶2傳代,7～10 天傳第一代,以后3～5 天傳代,傳至第三代進行流式細胞儀檢測。

1.3 流式細胞儀檢測 每瓶培養(yǎng)瓶加0.8 mL 胰酶,在培養(yǎng)箱中消化30 s,待細胞大部分變圓,加入培養(yǎng)液終止消化,吹打并收集細胞于離心管中,1 500 r/min離心5 min,PBS 重懸細胞,進行細胞計數(shù)。1 000 r/min離心8 min,以含1%小牛血清的PBS 重懸細胞,離心棄上清,加1 mL 含1%小牛血清的PBS 重懸細胞,移入1.5 mL 大EP 管,1 000 r/min 離心6～8 min,棄上清,加400 μL PBS,重懸,分裝8 支EP 管,每管50 μL 細胞懸液。加熒光直接標(biāo)記一抗,國產(chǎn)抗體為5 μL/100 μL,進口抗體為1 μL/100 μL,混勻,渦旋5 min,在4℃冰箱孵育20～30 min,PBS 洗3～5 次,每管加入0.5 mL PBS 重懸,上流式細胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs培養(yǎng)不同時間點形態(tài)學(xué)特征 以全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs,將骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶中,鏡下可見滿視野小圓形、懸浮的有核細胞。24 h 半量換液時可見少量散在的貼壁細胞,細胞形態(tài)幼小、短圓。48 h 半量換液及72 h 全量換液時可見貼壁細胞增多和少量克隆樣生長的細胞團,細胞形態(tài)稍變長,排列不緊密,間距較大（圖1）。通過換液逐漸清除未貼壁細胞,貼壁細胞得以純化,數(shù)量逐漸增多,間距逐漸變小,出現(xiàn)細胞集落和典型的長梭形或長形細胞（圖2）。原代BMSCs 生長比較緩慢,一般7～10 天傳第一代,傳代后細胞生長迅速,3～5 天傳一代,細胞間排列緊密,呈魚群樣或漩渦樣生長。通過傳代細胞不斷純化,傳到第三代細胞形態(tài)趨于一致,呈長梭形、旋渦狀或魚群樣生長,純度可達到98.6%以上（圖3、4）。

圖1 原代第2 天（100×）

圖2 原代第9 天（100×）

圖3 第3 代第2 天（100×）

圖4 第3 代第5 天（100×）

2.2 流式細胞儀檢測結(jié)果 采用流式細胞儀檢測第三代BMSCs 表面簇分化抗原（CD）,CD29 陽性率為99.0%（圖5）,CD34 陽性率公為1.5%（圖6）。CD45 陽性率公為0.8%（圖7）,說明獲得的BMSCs純度較高,基本排除了造血干細胞、單核細胞的干擾,與文獻報道的骨髓來源BMSCs 表面表達的蛋白分子相同（圖8）。

圖5 CD29 同型對照與BMSCs 表面CD29 表達率

圖6 CD34 同型對照與BMSCs 表面CD34 表達率

圖7 CD45 同型對照與BMSCs 表面CD45 表達率

圖8 BMSCs 表面CD 分子表達率

3 討 論

骨髓基質(zhì)干細胞是一種具有多向分化潛能的干細胞,當(dāng)給予不同的理化或生物環(huán)境,可以向軟骨細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞、脂肪細胞等分化[5-8],在骨重建和損傷組織再生中發(fā)揮重要作用[9],在股骨頭壞死[10]、軟骨損傷、肌腱缺損、骨骼肌損傷、皮膚損傷[11]、腦缺血[12]等疾病中也具有廣闊的應(yīng)用前景。

骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)方法主要有密度梯度離心法、免疫磁珠分離法、全骨髓培養(yǎng)法等[13]。前兩者需要特殊設(shè)備和技術(shù),雖然可得到高純度骨髓基質(zhì)干細胞,但離心和分選過程對細胞活性影響很大,甚至失活[14]。而全骨髓培養(yǎng)法操作簡單、成本低廉、技術(shù)要求不高,能模擬體內(nèi)骨髓環(huán)境,更適合細胞生長,且混雜的紅細胞、白細胞等隨著換液和傳代而被去掉,得到較純的BMSCs,因而被廣泛采用。但需注意的是,在原代培養(yǎng)過程中紅細胞密度過高會阻礙細胞貼壁,裂解產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物等對細胞產(chǎn)生毒害作用。因此適當(dāng)?shù)姆N植密度和換液是培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵[15]。

迄今為止,仍未發(fā)現(xiàn)BMSCs 特異性分子,國際細胞治療學(xué)會（International Society for Celluar Therapy,ISCT）提出了定義BMSCs 的三個標(biāo)準(zhǔn)[16]：（1）體外培養(yǎng)條件下BMSCs 必須貼壁生長;（2）BMSCs 必須積極表達多種抗原分子,如CD29、CD73、CD90、CD105,而不表達造血干細胞特異性表面抗原分子,如CD34、CD45 和單核細胞、B 淋巴細胞的表面標(biāo)志分子;（3）這些細胞在體外特定培養(yǎng)條件下至少可以向骨、軟骨和脂肪細胞三個方向分化。本實驗采用全骨髓培養(yǎng)法,流式細胞儀檢測細胞表面分子表達,結(jié)果顯示細胞CD29 表達陽性率達99%,而CD34 陽性率公1.5%,CD45 陽性率公0.8%,排除了造血干細胞、單核細胞等干擾,得到較高純度的BMSCs。