張 慧,余 端,杭曉寧,馬連杰,廖敦秀,盧文才

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,重慶 401329)

【研究意義】土壤是一個動態(tài)的生命系統(tǒng),提供各種生態(tài)系統(tǒng)服務(wù),包括養(yǎng)分循環(huán)、碳匯、水分調(diào)節(jié)等[1]。微生物是土壤的重要組成部分之一,在許多過程中發(fā)揮著重要作用,包括土壤團(tuán)聚體的形成[2]、土壤有機(jī)碳分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等[3]。土壤微生物群落豐度和組成變化是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中土壤生化過程和作物生產(chǎn)力的關(guān)鍵指標(biāo)[4]。施肥是一種常見的農(nóng)業(yè)管理措施,通過改變土壤理化性質(zhì)影響作物產(chǎn)量品質(zhì)及土壤微生物數(shù)量、活性及群落組成[5],其中氮肥在保持土壤肥力、提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)等方面發(fā)揮了重要作用,但是長期過量施用會引起土壤酸化板結(jié)、供肥能力下降等問題[6-7]。水稻-莖瘤芥輪作是西南丘陵地區(qū)重要的農(nóng)業(yè)種植方式之一,而水稻和莖瘤芥種植常存在盲目施肥、過量施肥等現(xiàn)象[8-9],不利于綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展。因此,為保障糧食安全和特色蔬菜生產(chǎn),針對西南丘陵區(qū)稻菜輪作模式,研究不同施氮處理對土壤微生物多樣性的影響,探索綠色高效的施氮方案,減少氮肥對農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的污染,實(shí)現(xiàn)丘陵山區(qū)稻田綠色生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明,相較于常規(guī)施肥,減施氮肥沒有明顯降低土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的多樣性[10]。也有研究指出適量減氮處理可以增加土壤中細(xì)菌菌落的多樣性和豐度[11]。與僅施用化肥相比,施用有機(jī)肥(如糞肥和稻草)能增強(qiáng)細(xì)菌和真菌群落數(shù)量和豐度[12-13],在一定程度上影響土壤微生物的生長發(fā)育[14];無機(jī)有機(jī)肥配施可顯著提高土壤微生物數(shù)量,也可改善微生物特性,提高土壤肥力[15]。陳凱鵬等[16]發(fā)現(xiàn)化肥減量配施秸稈能有效改善土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu),提高土壤固氮潛力。Xun等[17]研究表明,豬糞或牛糞有機(jī)肥替換部分化肥可以改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),增加土壤微生物數(shù)量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)氮肥減施、秸稈還田、不同耕作方式等對稻田微生物多樣性的影響研究較多,而關(guān)于水稻-莖瘤芥輪作下氮肥減施對土壤微生物多樣性的影響報道較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過分析不同施氮條件下稻田土壤中微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的差異,明確水稻-莖瘤芥輪作下施氮量對土壤真菌、細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響,以期為西南丘陵區(qū)水稻-莖瘤芥輪作下氮肥減量施用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于重慶市九龍坡區(qū)重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院高科技園區(qū)內(nèi)(106°21′E,29°27′N),種植模式為水稻-莖瘤芥輪作,土壤類型為沙溪廟組紫色水稻土。屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候,年平均氣溫16～18 ℃,年平均相對濕度70%～80%,年平均降水量1000～1300 mm,年平均日照時數(shù)1000～1400 h,日照百分率僅為25%～35%。土壤基本理化性質(zhì):有機(jī)質(zhì)含量15.71 g/kg,全氮含量0.684 g/kg,全磷含量0.645 g/kg,全鉀含量25.3 g/kg,有效磷含量12.5 mg/kg,速效鉀含量68 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)設(shè)置4個施氮處理,分別為不施氮肥(CK)、氮肥全量施用(即常規(guī)施肥量T1)、減施氮肥(T2)、氮肥有機(jī)肥配施(T3)處理,小區(qū)面積為84 m2(12 m×7 m),處理間設(shè)置0.5 m寬的田埂作為隔離帶,每處理重復(fù)3次,隨機(jī)排列。水稻氮肥分3次施入,分別為基肥、分蘗肥、穗肥,其中對照處理(CK)3次施氮量分別為0、0、0 kg/hm2,T1處理3次施氮量分別為75、60、15 kg/hm2,T2處理3次施氮量分別為60、45、15 kg/hm2,T3處理基肥為氮肥60 kg/hm2+有機(jī)肥200 kg/hm2,分蘗肥、穗肥施氮量分別為45、15 kg/hm2。試驗(yàn)中P2O5施用量均為90 kg/hm2,K2O施用量均為120 kg/hm2,尿素(N)、過磷酸鈣(P2O5)和鉀肥(K2O)的有效養(yǎng)分含量分別為46%、12%和60%,肥料均購自廣東天禾農(nóng)資股份有限公司。莖瘤芥是一次性施基肥,各處理田間管理保持一致。

1.3 土壤微生物檢測

水稻收獲后,采用5點(diǎn)取樣法,用土鉆在每個小區(qū)采集0～10 cm土層土樣,取混合土樣50 g,去除土樣中的植物殘體等雜質(zhì),放入保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室后置于超低溫冰箱,用于土壤真菌、細(xì)菌的豐度和多樣性測定。土壤樣品送到上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行Illumina Miseq高通量測序。對細(xì)菌的16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為:F-ACTCCTACGGGAGGCAGCA,R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT;對真菌ITS的V1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為:F-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG,R-GCTGCGTTCTTCATCGATGC。PCR反應(yīng)體系:擴(kuò)增體系25 μL,其中5×reaction buffer 5 μL,5×GC buffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,Forward primer(10 μmol/L)1 μL,Reverse primer(10 μmol/L)1 μL,DNA Template 2 μL,ddH2O 8.75 μL,Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。PCR 反應(yīng)條件:98 ℃ 2 min,98 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,25～30個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用Vsearch[18]方法對序列進(jìn)行去引物、拼接、質(zhì)量過濾、去重、去嵌合體、聚類,對樣本中所包含的高質(zhì)量序列進(jìn)行統(tǒng)計。采用稀疏的方法對ASV/OTU的豐度表進(jìn)行抽平[19-20],通過對抽平后的ASV/OTU表格進(jìn)行統(tǒng)計,獲得每個樣本中的微生物群落在各分類水平的具體組成表。Alpha和Beta多樣性分析采用QIIME、R語言、ape包等實(shí)現(xiàn)。為能較全面地評估微生物群落的Alpha多樣性,本試驗(yàn)以Chao1指數(shù)[21]和Observed指數(shù)表征豐富度,以Shannon指數(shù)[22]和Simpson指數(shù)[23]表征多樣性,Beta多樣性通過計算Bray-Curtis[24]距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)軸分析[25]。使用QIIME軟件,獲取各樣本在門水平上的組成和豐度分布表,比較微生物的分布情況。使用R語言、pheatmap包等進(jìn)一步比較樣本間的物種組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

16S序列測序數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接后,12個樣本共得到877 125條序列,每個樣本45 898～81 692條,平均序列長度為387 bp;97%相似性歸并后,CK、T1、T2、T3處理分別獲得9303、9371、10 514、10 114個細(xì)菌OUT。ITS序列測序數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接后,12個樣本共得到895 116條序列,每個樣本58 561～116 935條,平均序列長度為250 bp;97%相似性歸并后,CK、T1、T2、T3處理分別獲得880、1002、874、903個真菌OUT。不同處理下細(xì)菌和真菌群落在門、綱、目、科、屬上存在一定的差異,物種分類學(xué)注釋結(jié)果統(tǒng)計詳見表1。

表1 不同施氮處理下土壤細(xì)菌和真菌的物種分類學(xué)注釋結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Statistics of taxonomic annotation results of soil bacteria and fungi under different nitrogen treatments

2.2 微生物群落Alpha多樣性分析

土壤細(xì)菌和真菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果表明(表2),與CK相比,T1處理的細(xì)菌群落豐富度降低,T2、T3處理的細(xì)菌群落豐富度增加,但處理間差異不顯著(Chao1指數(shù)和Observed指數(shù),P>0.05);處理T1、T2、T3的細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于CK處理,差異未達(dá)顯著水平。處理T1、T2、T3的真菌Chao1指數(shù)和Observed指數(shù)均高于CK處理,而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均低于CK處理,處理間差異未達(dá)顯著水平。結(jié)果表明,各處理土壤真菌和細(xì)菌物種的均勻度一致,減施氮肥和氮肥有機(jī)肥配施可以增加細(xì)菌群落的豐富度,降低真菌群落的豐富度。

表2 不同施氮處理下土壤細(xì)菌、真菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)Table 2 Richness and diversity index of soil bacterial and fungal communities under different nitrogen treatments

2.3 微生物群落Beta多樣性分析

基于ASV分類學(xué)水平的PCoA分析,采用Bray-Curtis距離算法,得出細(xì)菌(圖1-A)群落和真菌(圖1-B)群落的PCoA第一坐標(biāo)貢獻(xiàn)度分別為16.0%和24.6%;CK、T1、T2、T3處理的土壤細(xì)菌群落組成基本相似,處理間的菌群結(jié)構(gòu)無明顯差異;CK、T1、T2處理的土壤真菌群落距離T3處理較遠(yuǎn),說明真菌物種組成有一定的差異性。結(jié)果表明,不同施氮處理對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大。

A.細(xì)菌;B.真菌。A.Bacteria;B.Fungi.圖1 基于Bray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)軸分析Fig.1 Principal coordinate axis analysis based on Bray-Curtis distance matrix

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)

由圖2-A可知,所有處理細(xì)菌群落中,變形菌門(Proteobacteria,相對豐度31.49%～34.57%)和放線菌門(Actinobacteria,相對豐度30.10%～34.57%)是最豐富的門,其次是綠彎菌門(Chloroflexi,相對豐度17.07%～20.77%)、酸桿菌門(Acidobacteria,相對豐度4.85%～5.71%),這4個優(yōu)勢菌門累計相對豐度為89.09%～89.77%;與CK處理相比,施氮處理增加了Proteobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes和Bacteroidetes的相對豐度,降低了Actinobacteria、Acidobacteria和Nitrospirae的相對豐度,但處理間差異不顯著。由圖2-B可知,所有處理真菌群落中,子囊菌門(Ascomycota)是最豐富的門,平均相對豐度為59.04%～74.06%,其次是被孢霉門(Mortierellomycota,相對豐度4.56%～9.55%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota,相對豐度1.72%～4.62%),這3個優(yōu)勢菌門累計相對豐度為70.90%～80.35%。與CK處理相比,施氮處理的Ascomycota相對豐度增加,羅茲菌門(Rozellomycota)和油壺菌門(Olpidiomycota)相對豐度顯著增加;T1處理的擔(dān)子菌門和球囊菌門(Glomeromycota)相對豐度增加;T2處理的被孢霉門相對豐度增加,毛霉門(Mucoromycota)相對豐度顯著降低;T3處理的毛霉門相對豐度增加,但處理間差異達(dá)不到顯著水平。

A.細(xì)菌;B.真菌。A.Bacteria;B.Fungi.圖2 不同施氮處理的土壤細(xì)菌和真菌門水平分布Fig.2 Horizontal distribution of soil bacteria and fungi under different nitrogen treatments

選取相對豐度排名前20的細(xì)菌和真菌菌屬,繪制Heatmap,色塊由藍(lán)到紅代表相對豐度由低到高。由圖3-A可知,CK、T3、T2處理的細(xì)菌群落組成相似度較高,屬于同一分枝;T1屬于另一聚類分枝。與CK相比,T1、T2、T3處理均降低了Thiobacillus、MB-A2-108菌屬和Subgroup_17的豐度,提高硫堿螺旋菌屬(Thioalkalispira)和Geobacter的豐度,處理間差異不顯著;T1處理中Latescibacteria、Sulfurifustis、A4b、67-14、KD4-96、分支桿菌(Mycobacterium)的豐度最高;處理T3的SJA-15豐度最高。由圖3-B可知, T3、T1和T2處理的真菌群落組成相似度較高,屬于同一分枝;CK處理屬于另一聚類分枝。與T3相比,T1、T2處理的頂囊殼屬(Gaeumannomyces)和Pyrenochaetopsis豐度增加;T2處理顯著增加了Mortierella和Neodevriesia的豐度;T3處理顯著提高了鏈孢霉(Neurospora)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Pseudaleuria、鐮刀菌屬(Fusarium)、Penicillium的豐度,降低了球腔菌屬(Mycosphaerella)、鏈格孢屬(Alternaria)、黃絲曲霉屬(Talaromyces)、Serendipita、Pseudeurotium、光黑殼屬(Preussia)、枝頂孢屬(Acremonium)、油瓶霉屬(Lecythophora)、Ramophialophora的相對豐度。

A.細(xì)菌;B.真菌。A.Bacteria;B.Fungi.圖3 不同施氮處理的土壤微生物組成Fig.3 Soil microbial composition under different nitrogen treatments

3 討 論

土壤微生物多樣性與群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)功能的穩(wěn)定性之間總體上存在線性關(guān)系,一般情況下,土壤微生物豐度越高,群落組成越復(fù)雜,土壤微生態(tài)的功能穩(wěn)定性越強(qiáng)[26-27]。施肥不均衡會導(dǎo)致土壤有效養(yǎng)分失衡、生產(chǎn)力下降,從而抑制土壤微生物活性,不利于參與土壤養(yǎng)分循環(huán)的微生物繁殖,進(jìn)而導(dǎo)致土壤微生物多樣性下降[28]。適量減施氮肥可以增加土壤中細(xì)菌群落的多樣性[11],有機(jī)無機(jī)肥配施能夠增加土壤微生物多樣性,改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[29]。本研究比較不同施氮處理的土壤微生物α多樣性,發(fā)現(xiàn)土壤中細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)變化趨勢各不相同,施用氮肥未能顯著改變土壤微生物群落豐度,這可能與莖瘤芥施肥有關(guān)[30]。從土壤細(xì)菌PCoA分析圖也可以看出,各處理土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)存在大量重疊區(qū)域,說明減施氮肥并未顯著改變土壤中細(xì)菌結(jié)構(gòu)。

水稻土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性易受土壤類型、土壤理化性質(zhì)、施肥方式等因素的影響[31]。高通量測序結(jié)果表明,變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門是施氮土壤中主要的細(xì)菌群落,以變形菌門和放線菌門為主,T3、T2處理的變形菌門相對豐度高于T1、CK處理,說明氮肥減施和氮肥有機(jī)肥配施有利于該類細(xì)菌的生長繁殖;CK處理的放線菌門相對豐度高于施氮處理,說明氮肥施用不利于放線菌門的生長;T2處理的硝化螺旋菌門、芽單胞菌門豐度高于其他處理,說明氮肥減施可為有益微生物生長提供有利的生境;綠彎菌門有利于土壤中有毒有害物質(zhì)的降解[32],其相對豐度T2處理高于其他處理,說明氮肥減施后土壤中的有毒有害物質(zhì)積累減弱,對土壤健康有益[33]。土壤中氮素含量顯著影響真菌的多樣性、豐度和組成[34]。不同施氮土壤中真菌的優(yōu)勢菌群均為子囊菌門,且施用氮肥處理的子囊菌門相對豐度均大于60%,這一結(jié)果說明子囊菌門的生長受氮素含量的影響較大,且氮肥會促進(jìn)其優(yōu)勢菌的生長[35]。

本研究在一定范圍內(nèi)揭示了水稻-莖瘤芥輪作條件下土壤細(xì)菌和真菌多樣性和結(jié)構(gòu)對不同施肥量的響應(yīng)。然而,土壤本身是一個復(fù)雜的系統(tǒng),受人為因素影響較大,對土壤細(xì)菌、真菌與其他理化因子的生物調(diào)控機(jī)理有待于深入挖掘。此外,不同施氮量對土壤病原真菌的影響還有待進(jìn)一步研究。雖然本研究在一定程度上分析了土壤細(xì)菌和真菌群落的組成,但具有一定的局限性,土壤細(xì)菌和真菌與氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能微生物仍有待深入研究。

4 結(jié) 論

長期氮肥減施、氮肥有機(jī)肥配施使土壤細(xì)菌群落豐富度升高,真菌群落的豐富度降低。氮肥配施有機(jī)肥與其他處理的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相似度較高,氮肥全量和氮肥減施處理的真菌菌群結(jié)構(gòu)相似度較高,其他處理間真菌結(jié)構(gòu)差異較大。不同氮肥施用水平的土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群均為變形菌門,真菌優(yōu)勢菌群均為子囊菌門,且氮肥施用均可提高土壤變形菌門、子囊菌門的相對豐度。在水稻-莖瘤芥輪作模式下,減施氮肥、氮肥有機(jī)肥配施對土壤中微生物群落組成和豐度沒有產(chǎn)生顯著影響,研究結(jié)果有助于準(zhǔn)確了解減氮處理的土壤微生物結(jié)構(gòu)變化,為氮肥減量施用提供理論支撐。