曹潤(rùn)潔，杜成龍，何宏魁，，馬金同，王 冕，袁志強(qiáng)，周鵬磊，馬葉勝

（1.安徽瑞思威爾科技有限公司，安徽亳州 236800；2.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州 236800）

酸性蛋白酶可應(yīng)用于不同工藝、不同香型白酒的生產(chǎn)，能在酸性環(huán)境下水解蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)微生物生長(zhǎng)及酶的形成，可形成白酒風(fēng)味物質(zhì)，使酒體豐滿醇厚，適合在釀酒的環(huán)境中發(fā)揮作用，有改善白酒風(fēng)味的作用，并能提高原酒品質(zhì)[1]。

白曲霉具有蛋白酶活性強(qiáng)、耐酸度高、培養(yǎng)條件粗放等特點(diǎn)[2]。本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的白曲霉菌株為目標(biāo)菌株，從生長(zhǎng)條件、產(chǎn)酶活力的關(guān)鍵工藝因素進(jìn)行研究分析，以提高白曲霉菌株的酸性蛋白酶活力為目的，探究高產(chǎn)酸性蛋白酶白曲霉實(shí)驗(yàn)室最佳培養(yǎng)條件，對(duì)其應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義[3]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗(yàn)原料及耗材

試驗(yàn)菌株：本公司選育、保藏的白曲霉（Aspergillus albicans）菌株M047，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)是CCTCC M 2022054。

菌種保藏（斜面）培養(yǎng)基：麥芽粉130.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，瓊脂15.0 g/L，蒸餾水1000 mL，pH 值6.0±0.2(25 ℃下)，121 ℃滅菌20 min。

種子（平板）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 值5.4～5.8(25 ℃下)，115 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：1 份高粱粉，加水4 份蒸煮0.5～1 h，按淀粉酶使用說(shuō)明加入淀粉酶進(jìn)行液化，液化后補(bǔ)加55～75 ℃溫水1 份，攪拌均勻，在55～75 ℃糖化0.5～1 h，稀碘液試之不顯藍(lán)色，用細(xì)紗布過(guò)濾，測(cè)量溶液的糖度并調(diào)整為8°～10°波美度，自然pH值，115 ℃滅菌20 min后使用。

三角瓶菌種培養(yǎng)基：250 mL 三角瓶裝入20 g麩皮和20 mL 水，攪拌均勻后封口膜封口，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 試劑及耗材

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、乳酸、甘油（均為分析純），國(guó)藥集團(tuán)；瓊脂（BR），國(guó)藥集團(tuán)；干酪素（BR），AOBOX；福林酚試劑（BR），羅恩試劑。

1.1.3 儀器設(shè)備

ME204E 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；一列八孔型電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科儀器有限公司；SX-700 型高壓滅菌鍋，TOMY KOGYO 公司；BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MHP-100 智能霉菌培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；UV9000型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；PhS3C/0-14 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將本公司選育、保藏的白曲霉菌株M047 制成孢子菌懸液，進(jìn)行平板涂布，置于30～32 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，做平板劃線培養(yǎng)[4]。

1.2.2 平板菌種的制備

將活化后的白曲霉菌株點(diǎn)接于種子（平板）培養(yǎng)基上，置于30～32 ℃智能霉菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36～48 h，白曲霉成熟后即可使用。

1.2.3 三角瓶菌種制備

250 mL三角瓶裝入20 g麩皮和20 mL水，攪拌均勻后封口膜或者棉塞進(jìn)行封口，每個(gè)三角瓶物料厚度在2 cm 左右，于121 ℃滅菌30 min，滅菌后趁熱將曲料搖松，冷卻至40 ℃左右接種，置于30～32 ℃智能霉菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后搖瓶1 次，再培養(yǎng)12～24 h即可完成培養(yǎng)。

1.2.4 福林酚法檢測(cè)菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的能力

三角瓶試驗(yàn)種曲制備：根據(jù)單因素試驗(yàn)或者正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)樣本需求，將上述三角瓶菌種按照一定的接種量接入三角瓶培養(yǎng)基中，按照設(shè)計(jì)的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程操作參照“1.2.3三角瓶菌種制備”方法。

根據(jù)上述制備種曲的方法制備試驗(yàn)菌株的試驗(yàn)種曲，利用國(guó)標(biāo)GB/T 23527—2009 福林酚法測(cè)酸性蛋白酶活力的方法測(cè)算試驗(yàn)菌株試驗(yàn)種曲的酸性蛋白酶活力值。

1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

從生長(zhǎng)條件、產(chǎn)酶活力的關(guān)鍵工藝因素進(jìn)行研究分析，以提高菌株白曲霉的酸性蛋白酶活力為目的，探究高產(chǎn)酸性蛋白酶白曲霉最適培養(yǎng)條件。以麩皮為主要原料，將培養(yǎng)基水分、培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等作為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，找出影響菌株生長(zhǎng)的顯著性因素并進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)其實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)基水分的選擇

培養(yǎng)基以麩皮為主要原料，對(duì)培養(yǎng)基水分設(shè)定6 個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)，加水量分別為原料量的60%、80 %、100 %、120 %、140 %和160 %。121 ℃滅菌30 min 后，冷卻至40 ℃左右，在無(wú)菌條件下接種白曲霉三角瓶菌種，置于32 ℃智能霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，檢測(cè)其酸性蛋白酶活力。

由圖1 可知，當(dāng)加水量為60%～100%時(shí)，菌體酸性蛋白酶活力隨著培養(yǎng)基加水量的增加而增加；當(dāng)加水量為100 %～160 %時(shí)，菌體酸性蛋白酶活力隨著培養(yǎng)基加水量的增加而減少。加水量為100%時(shí)，菌體酸性蛋白酶活力最高。

圖1 培養(yǎng)基水分添加量對(duì)白曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力的影響

2.1.2 培養(yǎng)基pH值的選擇

微生物的生長(zhǎng)需要在適宜的酸堿環(huán)境下，保持培養(yǎng)基水分添加量為100 %，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值為2、3、4、5、6、7，其他條件保持不變，培養(yǎng)完成后，檢測(cè)其酸性蛋白酶活力。

從圖2 可以看出，在培養(yǎng)基pH 值為4 時(shí)菌體酸性蛋白酶的活力最高，故選擇培養(yǎng)基的pH值為4。

圖2 培養(yǎng)基pH值對(duì)白曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力的影響

2.1.3 培養(yǎng)溫度的選擇

保持培養(yǎng)基水分添加量為100%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值為4，其他條件保持不變，對(duì)培養(yǎng)溫度設(shè)定6 個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)，溫度分別為26 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃、42 ℃和46 ℃，培養(yǎng)48 h 后，檢測(cè)其酸性蛋白酶活力。

由圖3 可知，菌體培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)溫度對(duì)菌體的酸性蛋白酶活力影響較大。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于38 ℃時(shí)，菌體的酸性蛋白酶活力隨著溫度的升高呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)溫度高于38 ℃時(shí)，菌體的酸性蛋白酶活力隨著溫度的升高呈遞減趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為38 ℃時(shí)，菌體的酸性蛋白酶活力表現(xiàn)最優(yōu)。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)白曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力的影響

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

培養(yǎng)基的水分添加量為100 %，培養(yǎng)基的pH值為4，培養(yǎng)溫度38 ℃，選擇36 h、48 h、60 h、72 h、84 h 和96 h 總共6 個(gè)梯度作為培養(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)其酸性蛋白酶活力的大小確定培養(yǎng)時(shí)間。

通過(guò)圖4 可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體酸性蛋白酶活力逐漸升高，當(dāng)培養(yǎng)72 h 時(shí)，曲樣的酸性蛋白酶活力最高，但隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體出現(xiàn)老化，菌體的酸性蛋白酶活力逐漸降低，故選擇72 h為培養(yǎng)時(shí)間。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)白曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)培養(yǎng)基水分添加量、培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)分析，正交試驗(yàn)因素選取水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析見(jiàn)表2。

表1 菌株培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因素水平

表2 菌株培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析

由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響菌株生長(zhǎng)的最大因素為培養(yǎng)溫度，其次分別為培養(yǎng)基的水分、培養(yǎng)基pH 值及培養(yǎng)時(shí)間。從方差分析與顯著性分析結(jié)果可以看出，不同水分添加量、不同培養(yǎng)基pH值、不同培養(yǎng)時(shí)間樣本對(duì)于酸性蛋白酶活力（U/g）均不表現(xiàn)出顯著性差異，不同培養(yǎng)溫度樣本對(duì)于酸性蛋白酶活力（U/g）均呈現(xiàn)出顯著性差異。

4 個(gè)因素的最佳組合是A2B3C2D2，即培養(yǎng)基水分添加量為100 %，培養(yǎng)基pH 值為5，培養(yǎng)溫度38 ℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。

按照所得出的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行白曲霉的培養(yǎng)試驗(yàn)，設(shè)置3 個(gè)水平培養(yǎng)樣本，計(jì)算其酸性蛋白酶活力的平均值（結(jié)果如表4），最后得到菌體酸性蛋白酶的活力為526.09 U/g。

表4 菌株在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后的酸性蛋白酶活力

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)白曲霉培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)基以麩皮作為主要原料，確定培養(yǎng)基水分添加量、培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間為影響菌株生長(zhǎng)的顯著因素。對(duì)4 組顯著性因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)[5]，得到菌株實(shí)驗(yàn)室最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基水分添加量為100 %，培養(yǎng)基pH 值為5，培養(yǎng)溫度38 ℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。在此培養(yǎng)條件下對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)可以顯著提高菌株的酸性蛋白酶活力，酸性蛋白酶活力值可以達(dá)到526.09 U/g。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

酸性蛋白酶能在釀酒的酸性環(huán)境中，通過(guò)對(duì)原料中蛋白質(zhì)的水解，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)及酶的形成產(chǎn)生白酒風(fēng)味物質(zhì)，使酒體豐滿醇厚[6]。提高白曲霉的酸性蛋白酶活力，探究高產(chǎn)酸性蛋白酶白曲霉實(shí)驗(yàn)室最佳培養(yǎng)條件，對(duì)其應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。