摘要目的：探討天麻苷元抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞自噬和抗凋亡的機(jī)制。方法：使用細(xì)胞AngⅡ處理大鼠心肌細(xì)胞系H9c2以模擬體外心臟肥大模型，通過轉(zhuǎn)染siRNA-PPAR-α敲低心肌細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）的表達(dá)，采取3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制細(xì)胞自噬。分別通過二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法、實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）、流式細(xì)胞術(shù)及蛋白免疫印跡法（Western Blot）測定H9c2細(xì)胞中的細(xì)胞活力、心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物B型鈉尿肽（BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）、過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPAR-α）的表達(dá)、凋亡及自噬現(xiàn)象。結(jié)果：天麻苷元抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大、自噬及凋亡。敲低心肌細(xì)胞中PPAR-α的表達(dá)后，天麻苷元對H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用略有削減，自噬抑制劑則部分逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。結(jié)論：天麻苷元介導(dǎo)PPAR-α抑制自噬從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞心力衰竭；心肌細(xì)胞；天麻苷元；過氧化物酶體增殖物激活受體α，PPAR-α；細(xì)胞自噬；細(xì)胞凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.009

由于心肌缺血的高發(fā)病率和死亡率，其仍然是導(dǎo)致死亡的主要原因，恢復(fù)血液供應(yīng)是目前缺血性心血管疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法［1-2］。然而，再灌注可觸發(fā)復(fù)雜的級聯(lián)事件和二次損傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、壞死或自噬［3-4］。細(xì)胞凋亡和自噬是與心力衰竭發(fā)展相關(guān)的2種細(xì)胞死亡類型。自噬對于清除受損細(xì)胞和細(xì)胞器十分重要，但過度的自噬活動可能會導(dǎo)致心力衰竭［5］。心肌細(xì)胞自噬與心肌肥大密切相關(guān)［6］。在中度橫向主動脈縮窄模型中，自噬的上調(diào)和蛋白質(zhì)合成的下調(diào)都參與了心臟肥大的消退［7］。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是血壓的體液調(diào)節(jié)劑，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的關(guān)鍵效應(yīng)物［8］。AngⅡ也是直接影響血流動力學(xué)的關(guān)鍵細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和凋亡［9-10］。近年來，天然產(chǎn)物作為新型抗心肌缺血藥物的潛在來源受到了越來越多的關(guān)注［11-12］。天麻（gastrodia elata blume）具有廣泛的生物活性。天麻苷元（gastrodigenin，HBA）又稱對羥基苯甲醇，是天麻的主要有效成分之一。天麻苷元具有抗炎、抗抑郁、腦缺血保護(hù)等作用［13-15］。研究顯示，天麻素對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［16］。本研究探討天麻苷元對心肌細(xì)胞H9c2的保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌H9c2細(xì)胞系購自Procell Life Science amp; Technology有限公司。胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司。Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清（FBS）購自Gibco公司。siRNA-NC/過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）由GenePharma Co.，Ltd公司化學(xué)合成，3-甲基腺嘌呤（3-MA，M9281）購自Sigma公司。天麻苷元購自Sigma-Aldrich公司，純度為99%。PPAR-α（1∶1 000，ab126285，52 kDa）、Beclin-1（ab207612，1∶2 000，52 kDa）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）-Ⅰ/Ⅱ（ab128025，1∶2 000，16/14 kDa）均購自Abcam公司。Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）（＃111035003 USA）購自Immuno Research公司。

1.2細(xì)胞分組

在細(xì)胞密度達(dá)到60%后，使用Lipofectamine 2000用siRNA雙鏈體或?qū)φ誷iRNA（50 nmol）轉(zhuǎn)染細(xì)胞并孵育24 h。將H9c2大鼠胚胎心肌細(xì)胞分為8個不同的處理組，1）control組：H9c2細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；2）AngⅡ組：H9c2細(xì)胞用10 mol/L AngⅡ培養(yǎng)24 h；3）AngⅡ＋DMSO組：H9c2細(xì)胞與AngⅡ一起培養(yǎng)24 h，然后加入DMSO再培養(yǎng)24 h；4）AngⅡ＋HBA組：H9c2細(xì)胞與AngⅡ一起培養(yǎng)24 h，然后加入25 mmol HBA再培養(yǎng)24 h；5）AngⅡ＋HBA＋siRNA-NC組：在H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-NC，隨后H9c2細(xì)胞與AngⅡ一起培養(yǎng)24 h，然后加入25 mmol HBA再培養(yǎng)24 h；6）AngⅡ＋HBA＋siRNA-PPAR-α組：在H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-PPAR-α，隨后H9c2細(xì)胞與AngⅡ一起培養(yǎng)24 h，然后加入25 mmol HBA再培養(yǎng)24 h；7）AngⅡ＋HBA＋siRNA-PPAR-α＋3-MA組：用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA，10 mmol）預(yù)處理siRNA-PPAR-α轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞，隨后H9c2細(xì)胞與AngⅡ一起培養(yǎng)24 h，然后加入25 mmol HBA再培養(yǎng)24 h；8）AngⅡ＋HBA＋siRNA-PPAR-α＋DMSO組：使用等量DMSO預(yù)處理siRNA-PPAR-α轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞，隨后H9c2細(xì)胞與AngⅡ一起培養(yǎng)24 h，然后加入25 mmol HBA再培養(yǎng)24 h。

1.3二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法測定細(xì)胞活力

用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞以1×104個細(xì)胞/孔接種到96孔板中。暴露于不同處理后，然后加入20 μL MTT溶液（終濃度，5 mg/mL），隨后去除上清液。將甲臜晶體溶解在DMSO中。使用酶標(biāo)儀（Berthold LB941；Berthold Group，Ltd.，Wildbad，Germany）測量570 nm處的吸光度。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC/PI）染色后，收獲細(xì)胞并使用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）分析細(xì)胞凋亡。細(xì)胞被胰蛋白酶消化并在冷PBS中洗滌2次。1 000×g離心5 min后，收集細(xì)胞并濃縮至每孔1×106個細(xì)胞。將0.1 mL懸浮液與5 μL FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V混合，在室溫下避光孵育15 min，然后與5 μL PI混合并孵育5 min。然后使用流式細(xì)胞儀（FACSCanto Ⅱ，BD Biosciences，US）分析樣品。

1.5實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

通過異硫氰酸胍-苯酚法（TRIzol法）從細(xì)胞中提取總RNA，使用UV spectrophotometer（UV-1800，Japan）測定RNA濃度和純度。使用PrimescriptTM RT reagent kit（Takara，Japan）將2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）上，使用Dy NAmoTMSYBRGreen qPCR Kits（芬蘭Finnzymes公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸34 s，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCt法［17］進(jìn)行分析。所用引物序列如下：PPAR-α，正向?yàn)?′-GTGCCTGTCTGTCGGGATAG-3′，反向?yàn)?′-TCTTCAGGTAGGCTTCGTGGAT-3′；BNP，正向?yàn)?′-CAGAAGCTGCTGGAGCTGATAAG-3′，反向?yàn)?′-TGTAGGGCCTTGGTCCTTTG-3′；β-MHC，正向?yàn)?′-GGCTGGCTACAGAAGAACAAG-3′，反向?yàn)?′-TACAGGTGCATCAGCTCCAG-3′；β-actin，正向?yàn)?′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′，反向?yàn)?′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。

1.6蛋白免疫印跡法（Western Blot）

收集細(xì)胞，裂解液裂解（磷酸酶抑制劑，蛋白酶抑制劑和PMSF），二辛可酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。10～20 mg蛋白在丙烯酰胺-Bis凝膠上樣，通過0.22 μm孔徑的PVDF膜（Merck Millipore，USA）進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗4 ℃孵育過夜。次日加入二抗室溫下孵育1 h，滴發(fā)光液（Thermo Fisher Scientific，中國）后進(jìn)行曝光顯色。用Image J軟件分析，以相應(yīng)蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量，重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用Tukey′s 多重比較檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1天麻苷元防止AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大

將H9c2細(xì)胞與AngⅡ孵育24 h，并檢測肥大標(biāo)志物BNP和β-MHC。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞比較，受到AngⅡ刺激的H9c2細(xì)胞BNP和β-MHC表現(xiàn)出更高水平（P＜0.01），表明AngⅡ成功誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。H9c2細(xì)胞與AngⅡ共培養(yǎng)24 h，然后加入25 mmol HBA再培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，天麻苷元顯著逆轉(zhuǎn)了AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞BNP和β-MHC表達(dá)的增加（P＜0.01），表明天麻苷元可防止AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。詳見圖1。

2.2天麻苷元抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

MTT檢測結(jié)果顯示，天麻苷元顯著提升心肌細(xì)胞活力（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后，H9c2細(xì)胞凋亡被促進(jìn)，而天麻苷元的治療部分逆轉(zhuǎn)AngⅡ造成的心肌細(xì)胞凋亡（P＜0.01），表明天麻苷元能夠促使心肌細(xì)胞抗凋亡。詳見圖2～圖4。

2.3天麻苷元通過介導(dǎo)PPAR-α抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

通過qRT-PCR及Western Blot檢測PPAR-α在H9c2細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，AngⅡ降低PPAR-α的表達(dá)，而天麻苷元逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象；在心肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染siRNA-PPAR-α后PPAR-α表達(dá)水平明顯下降，表明轉(zhuǎn)染成功（P＜0.01）。此外，心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物BNP和β-MHC的表達(dá)水平隨著PPAR-α的敲低而明顯上升（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，在天麻苷元治療的心肌細(xì)胞中敲低PPAR-α顯著促進(jìn)了心肌細(xì)胞的凋亡（P＜0.01）。表明天麻苷元通過介導(dǎo)PPAR-α抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖5～圖10。 圖5各組PPAR-α mRNA表達(dá)水平比較

2.4天麻苷元介導(dǎo)PPAR-α抑制自噬從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

通過檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1確定天麻苷元對細(xì)胞自噬的影響。Western Blot結(jié)果顯示，在AngⅡ刺激的H9c2細(xì)胞中，天麻苷元顯著抑制Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)，表明細(xì)胞自噬被天麻苷元所抑制；在天麻苷元治療的心肌細(xì)胞中敲低PPAR-α后Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)顯著上升，表明敲低PPAR-α促進(jìn)細(xì)胞自噬（P＜0.01）。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證天麻苷元介導(dǎo)PPAR-α抑制細(xì)胞自噬，添加自噬抑制劑觀察細(xì)胞變化。Western Blot結(jié)果顯示，添加自噬抑制劑（3-MA）之后，被敲低PPAR-α表達(dá)而提升的細(xì)胞自噬水平受到顯著抑制（P＜0.05）。此外，分別通過qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)對心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物及細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，添加自噬抑制劑之后，心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物相對表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡均顯著下降（P＜0.05）。表明天麻苷元介導(dǎo)PPAR-α抑制自噬從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖11～圖15。

3討論

心力衰竭是指心排血量不足以滿足機(jī)體需要的一種生理狀態(tài)［18］。任何降低心肌工作效率的情況都可能導(dǎo)致心力衰竭，心臟肥大是一種常見的病理變化，會增加心血管疾病的發(fā)病率和死亡率。研究表明，持續(xù)病理性肥大是心力衰竭的關(guān)鍵進(jìn)展因素和預(yù)測標(biāo)志物［19］。因此，預(yù)防心肌肥厚對于抑制心力衰竭的發(fā)展和改善病人預(yù)后具有重要意義。

盡管影響心肌肥大的因素和調(diào)節(jié)因子很多，但RAS及其主要效應(yīng)肽AngⅡ參與了心臟肥大和衰竭的病理生理學(xué)。本研究結(jié)果顯示，高濃度天麻苷元對心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力有輕微的抑制作用，而較低濃度的天麻苷元表現(xiàn)出心臟保護(hù)作用。在本研究中，采用qRT-PCR檢測肥大相關(guān)基因的表達(dá)水平，AngⅡ處理24 h顯著上調(diào)BNP和β-MHC mRNA水平，但這些變化在使用天麻苷元治療后顯著逆轉(zhuǎn)，即天麻苷元可有效抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的肥大基因的表達(dá)，發(fā)揮減緩肥大過程的作用。

作為核受體，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是炎癥、脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PPAR是一種配體誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，是Ⅱ型核受體超家族的成員［20］。心臟肥大過程中，心臟能量底物的利用從脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵鳳PAR-α的功能障礙在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［21］。在心肌肥大中，心臟PPAR-α蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性下降，PPAR-α基因敲除小鼠慢性壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌肥厚增強(qiáng)［22-23］。此外，有研究報道，腦心通通過增加PPAR-α蛋白水平，抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和自噬［24］。Kumari等［25］研究結(jié)果顯示，PPAR-α信號可能充當(dāng)細(xì)胞凋亡和自噬之間的分子開關(guān)，從而在心臟肥大的適應(yīng)性過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

自噬將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)或細(xì)胞器輸送到溶酶體中進(jìn)行降解［26］。在應(yīng)對饑餓壓力時，自噬會提高細(xì)胞存活率；然而，沒有新的營養(yǎng)補(bǔ)充的長期自噬會導(dǎo)致所有可用底物的消化和死亡（自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡）［26］。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ顯著誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大、凋亡及自噬，天麻苷元逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。

綜上所述，天麻苷元通過介導(dǎo)PPAR-α表達(dá)減少H9c2細(xì)胞自噬，抑制H9c2細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

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（收稿日期：2022-11-11）

（本文編輯鄒麗）