摘要目的：研究白楊素對腦缺血再灌注（CI/RI）大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷和自噬的緩解作用。方法：45只Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為Sham組、Model組、白楊素50 mg/kg組、白楊素100 mg/kg組、尼莫地平10 mg/kg組。除Sham組外，其他各組建立CI/RI大鼠模型。白楊素50 mg/kg組、白楊素100 mg/kg組分別給予白楊素50、100 mg/kg灌胃，每日1次；尼莫地平10 mg/kg組腹膜內(nèi)注射尼莫地平10 mg/kg，每日1次；Sham組、Model組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)7 d。Y迷宮實驗評價各組大鼠行為學；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理損傷；試劑盒檢測總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化氫（H2O2）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、還原性谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測自噬標志蛋白Beclin-1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）表達水平及核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶-1（HO-1）通路蛋白表達水平。結(jié)果：與Sham組比較，Model組大鼠Y迷宮實驗檢測新異臂進入次數(shù)明顯降低（P＜0.01）；腦組織細胞擺列狀態(tài)散亂；T-AOC和CAT活力明顯下降，SOD和GSH活性明顯降低，而H2O2與MDA含量明顯上升（P＜0.01）；LC3-Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1的蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。與Model組比較，白楊素治療明顯改善腦組織病理損傷和增加新異臂進入次數(shù)（P＜0.05）；T-AOC和CAT活力明顯增加，SOD和GSH活性明顯上升，而H2O2與MDA含量明顯下降（P＜0.05）；LC3-Ⅱ、Beclin-1、Nrf2和HO-1的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：白楊素治療可抑制CI/RI損傷引起的機體氧化應(yīng)激和自噬，其潛在機制或與白楊素對Nrf2/HO-1通路的活化有關(guān)。

關(guān)鍵詞腦缺血再灌注損傷；白楊素；微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ；Y迷宮實驗；Beclin-1

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.011

Effect of Chrysin on Inhibiting Oxidative Stress and Excessive Autophagy after Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rats

ZHANG Fang， LI Wenjie， DONG Yongshu， HAN Dong， WANG Dongxiao

The Second People′s Hospital of Jiaozuo， Jiaozuo 454100， Henan， China

Corresponding AuthorLI Wenjie， E-mail： zf19771216@sina.com

AbstractObjective：To study the mitigation effects of chrysin on oxidative stress injury and autophagy in cerebral ischemia reperfusion（CI/RI） rats.Methods：Forty-five Sprague-Dawley（SD） rats were randomly divided into Sham group，Model group，chrysin 50 mg/kg group，chrysin 100 mg/kg group，nimodipine 10mg/kg group.CI/RI rat models were established in other groups except Sham group.Chrysin 50 mg/kg group and chrysin 100 mg/kg group were given chrysin 50 and 100 mg/kg intragastric administration，once a day，respectively.Nimodipine 10 mg/kg group was intraperitoneally injected with nimodipine 10 mg/kg once a day.Sham group and Model group were given" same volume of normal saline once a day.After continuous intervention for 7 days.Y Maze experiment was used to evaluate the behavior of rats in each group.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological injury of cerebral tissue.Total antioxidant capacity（T-AOC），catalase（CAT） and hydrogen peroxide（H2O2），glutathione peroxidase（GSH-Px），glutathione（GSH），superoxide dismutase（SOD），and malondialdehyde（MDA） were detected by the kit.Western Blot analysis was performed to detect the expression levels of Beclin-1，microtubule-associated protein" light chain 3-Ⅱ（LC3-Ⅱ） and nuclear factor E2-related factor（Nrf2）/heme oxygenase 1（HO-1） pathway proteins.Results：Compared with the Sham group，Y maze test of Model group the number of new arm entry significantly reduced（P＜0.01）.Cerebral tissue cells" arranged in a disorganized state.The activities of T-AOC and CAT significantly decreased，the activities of SOD and GSH significantly decreased，and the contents of H2O2 and MDA significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）.The protein expression levels of LC3-Ⅱ，Beclin-1，Nrf2 and HO-1" significantly increased（P＜0.05）.Compared with the Model group，chrysin treatment significantly improved the pathological injury of cerebral tissue and increased the entry times of new arm（P＜0.05 or P＜0.01）.The activities of T-AOC and CAT significantly increased，the activities of SOD and GSH" significantly increased，while the contents of H2O2 and MDA" significantly decreased（P＜0.05）.The protein expression levels of LC3-Ⅱ，Beclin-1，Nrf2 and HO-1" significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion：The oxidative stress and autophagy induced by CI/RI injury can be inhibited by the treatment of chrysin，and the underlying mechanism may be related to the activation of Nrf2/HO-1 pathway by chrysin.

Keywordscerebral ischemia reperfusion injury; chrysin; microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ， LC3-Ⅱ; Y maze experiment; Beclin-1

腦卒中是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管疾病，是全球范圍內(nèi)致殘和致死的主要原因，其中缺血性腦卒中約占85%［1］。缺血性腦卒中引起一系列不良反應(yīng)，最終導致神經(jīng)元死亡和腦內(nèi)支持結(jié)構(gòu)的損傷。目前，有效的治療方法是及時的藥物溶栓，然而，藥物溶栓治療受限于其嚴格而狹窄的治療窗口期（＜4.5 h），主要風險為出血及再灌注的潛在損害［2］。缺血性腦卒中的發(fā)病機制包括興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥、自噬和凋亡，其中自噬被認為是腦缺血/再灌注損傷（CI/RI）的關(guān)鍵事件［3］。白楊素（Chrysin）是提取于紫葳科植物木蝴蝶中的一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、自噬等藥理活性［4-6］。研究表明，氧化應(yīng)激損傷、自由基損傷、炎性反應(yīng)、自噬等在腦缺血病理的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［7-9］。本研究探討白楊素對CI/RI大鼠認知功能、氧化應(yīng)激和自噬的影響，并探討其相關(guān)機制，旨在為CI/RI及其潛在損害的治療提供思路和策略。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物來源及分組

45只5～7周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，使用許可證號：SYXK（京）2017-0033。本研究經(jīng)我院動物管理倫理委員會討論通過，倫理編號：IACUC2020-045。所有大鼠均置于無菌環(huán)境（溫度23 ℃，相對濕度50%），保持12 h的明暗循環(huán)，并提供干凈的食物和水。將大鼠隨機分為Sham組、Model組、白楊素50 mg/kg組、白楊素100mg/kg組、尼莫地平10mg/kg組，每組9只。

1.1.2實驗試劑

白楊素（5，7-二羥基黃酮）（純度＞98%，貨號：12333345，陜西嘉通生物制品有限公司）；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫（H2O2）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、還原性谷胱甘肽（GSH）試劑盒（貨號：20130926、20130928、20130924、20130924、20130929、20130921、20130930，南京建成生物工程研究所）；雙二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（貨號：R23183-250T，上海源葉生物科技有限公司）；Trizol試劑盒（貨號：20180108，invitrogen公司，美國）。

1.1.3實驗儀器

奧林巴斯BX51光學顯微鏡（奧林巴斯，日本），切片機（Leica RM2015，德國），電泳儀（北京六一儀器廠，中國）。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型建立

根據(jù)文獻［8］復(fù)制CI/RI大鼠模型。通過加熱的手術(shù)平臺保持（37.0±0.5）℃，大鼠腹膜內(nèi)注射50 mg/kg戊巴比妥麻醉后仰臥固定，下頜骨至胸骨柄處正中縱向切口，雙重結(jié)扎頸總動脈近心端，分離頸外動脈并結(jié)扎。分離頸內(nèi)動脈，用微型動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，于頸外動脈壁處開口插入線栓，將線栓插入頸總動脈內(nèi)，絲線結(jié)扎頸外動脈，移除動脈夾，將線栓移至大腦中動脈，誘導腦缺血2 h后將線栓拔出，解開線結(jié)以完成CI/RI模型。Sham組大鼠僅將線栓略插入頸內(nèi)動脈，未導致腦中動脈閉塞。白楊素濃度參照文獻報道［10］，白楊素50 mg/kg組、白楊素100 mg/kg組分別給予白楊素50、100 mg/kg灌胃，每日1次；尼莫地平10 mg/kg組腹膜內(nèi)注射尼莫地平10 mg/kg，每日1次；Sham組、Model組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)7 d，并記錄大鼠體質(zhì)量變化。

1.2.2行為學評價指標

Y迷宮實驗：將大鼠放入Y迷宮中適應(yīng)環(huán)境，三臂燈均亮1 min后熄滅。打開大鼠不在的一臂燈，持續(xù)5 s（燈亮臂為安全區(qū)），將其余兩臂通電（電壓50 V），隨機亮燈。記錄大鼠到達安全區(qū)的時間（30 s內(nèi)到達有效，否則失敗），燈亮持續(xù)30 s，然后熄滅，1次實驗結(jié)束。持續(xù)訓練大鼠，直到1 d內(nèi)成功學會?！罢_反應(yīng)”為大鼠在通電刺激后10 s內(nèi)沖向安全區(qū)域，否則為“錯誤反應(yīng)”。成功的訓練為連續(xù)10次刺激中有9次或更多的正確反應(yīng)。記錄新異臂進入次數(shù)以評估大鼠的空間識別、記憶能力和活動能力。

1.2.3神經(jīng)功能缺損評分

神經(jīng)功能缺損評分由1名對實驗不知情的檢查者進行評估，在再灌注后24 h及最后1次給藥24 h后，參照文獻［9］進行評估：0分為表現(xiàn)正常，1分為大鼠無法完全伸展左前腿，2分為大鼠走路向左盤旋，3分為大鼠走路向左傾斜，4分為大鼠失去意識。

1.2.4蘇木精-伊紅（HE）染色

最后1次給藥24 h后，每組取3只大鼠腹膜內(nèi)注射戊巴比妥50 mg/kg麻醉，快速斷頭取腦，從視交叉向后2 cm切取腦組織，置于4%多聚甲醛中固定72 h后進行石蠟包埋制作切片備用，切片厚度為5 μm，每組再取6只大鼠腹腔麻醉后斷頭取新鮮腦組織，于－20 ℃冰箱冰凍20 min備用。取各組大鼠腦組織切片于室溫下進行蘇木精染色4～10 min，之后伊紅染色0.5～2.0 min。使用奧林巴斯BX51光學顯微鏡觀察腦組織病理學變化。

1.2.5氧化應(yīng)激指標檢測

取腦組織標本，稱重后按質(zhì)量體積比1∶9加入冰生理鹽水，使用組織勻漿器在冰水浴中勻漿。按不同指標測定的要求采用相應(yīng)的轉(zhuǎn)速離心，并取上清分裝，保存于－80 ℃冰箱中。T-AOC、CAT、H2O2、GSH-Px、GSH、SOD和MDA的測定具體按照操作說明書進行。

1.2.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和肌球蛋白樣Bcl-2 結(jié)合蛋白（Beclin-1）mRNA水平

使用Trizol試劑提取腦組織的總RNA，并用 PrimeScriptTMRT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)制造商的說明，使用SYBR Green Master Mix反應(yīng)試劑，與20 μL cDNA共同孵育，在Prism 7500實時進行PCR擴增，使用2－ΔΔCt方法計算RNA表達，β-actin作為內(nèi)參。

1.2.7蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測LC3-Ⅱ、Beclin-1、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）和血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白表達水平

收集各組大鼠腦組織，按照說明書提取組織總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg總蛋白上樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）緩沖液中，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶在37 ℃下密封PVDF膜2 h。然后，將其與以下一抗在4 ℃下孵育過夜：膜型LC3（LC3-Ⅱ）（ab192890，1∶2 000），Beclin-1（ab210498，1∶1 000），Nrf2（ab92946，1∶1 000），HO-1（ab189491，1∶2 000），內(nèi)參β-actin（1∶1 000）。隨后，將PVDF膜與山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗在37 ℃孵育60 min。傾去抗體混合液，用5 mL洗液漂洗3次，每次5 min。增強型化學發(fā)光試劑（ECL）顯色曝光，采用Image J分析內(nèi)參β-actin和目標條帶的灰度值，目標條帶蛋白水平＝目標條帶的灰度值/β-actin的灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1白楊素對CI/RI大鼠體質(zhì)量和行為學的影響

與Sham組比較，Model組大鼠體質(zhì)量增加，Y迷宮實驗檢測新異臂進入次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與Model組比較，白楊素50 mg/kg組、白楊素100 mg/kg組、尼莫地平10 mg/kg組大鼠體質(zhì)量降低，Y迷宮實驗檢測新異臂進入次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。表明一定濃度的白楊素治療可改善CI/RI大鼠行為學異常。詳見表1。

2.2白楊素對CI/RI大鼠腦損傷的影響

與Sham組比較，Model組大鼠腦組織細胞排列紊亂，胞核固縮深染，細胞間隙變大，大量空泡樣改變，表明腦組織出現(xiàn)明顯損傷；與Model組比較，經(jīng)白楊素治療可改善各組大鼠腦組織病理損傷，腦組織細胞排列較規(guī)整，細胞固縮程度較輕，空泡樣改變減少。與Sham組比較，Model組大鼠神經(jīng)功能損傷評分明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與Model組比較，白楊素50 mg/kg組、白楊素100 mg/kg組、尼莫地平10 mg/kg組大鼠神經(jīng)功能損傷評分明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。表明一定濃度的白楊素治療可改善CI/RI引起的大鼠腦組織損傷。詳見圖1、圖2。

2.3白楊素對氧化應(yīng)激指標的影響

與Sham組比較，Model組T-AOC、CAT、GSH-Px、SOD和GSH活力明顯下降，H2O2和MDA含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與Model組比較，白楊素100mg/kg組、尼莫地平10 mg/kg組T-AOC、CAT、GSH-Px、SOD和GSH活力明顯升高，H2O2和MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.4白楊素對CI/RI大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和Beclin-1表達水平的影響

與Sham組比較，Model組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）。與Model組比較，白楊素50 mg/kg組、白楊素100 mg/kg組、尼莫地平10 mg/kg組LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。與Sham組比較，Model組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。與Model組比較，白楊素50 mg/kg組、白楊素100 mg/kg組、尼莫地平10 mg/kg組LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。詳見圖3～圖5。

2.5白楊素對CI/RI大鼠腦組織中Nrf2/HO-1通路蛋白的影響

與Sham組比較，Model組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。與Model組比較，白楊素50mg/kg組、白楊素100 mg/kg組、尼莫地平10 mg/kg組Nrf2和HO-1的蛋白表達水平升高（P＜0.05）。詳見圖6、圖7。

3討論

由于生活方式的轉(zhuǎn)變，腦血管疾病已成為危害人類健康和生命的主要疾病之一，因大腦中動脈阻塞引起急性血流障礙，引發(fā)突發(fā)性局灶性腦功能障礙，導致感覺、運動功能喪失甚至死亡［11］。CI/RI是由于溶栓等療法進行再灌注時引起的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷［12］。本研究結(jié)果顯示，白楊素治療可以改善大鼠CI/RI引起的行為學異常，降低腦組織病理和功能損傷，抑制氧化應(yīng)激和細胞自噬的發(fā)生。急性腦缺血可導致缺血部位發(fā)生氧化應(yīng)激，釋放大量自由基并破壞細胞結(jié)構(gòu)，運用具有自由基清除功效的藥物可以防止這些損傷的發(fā)生［13-14］。研究表明，白楊素具有抗氧化和清除自由基的作用［15］。本研究結(jié)果表明，與Sham組比較，Model組大鼠腦組織中抗氧化系統(tǒng)指標T-AOC、CAT、GSH、GSH-Px及SOD活性均明顯降低。機體內(nèi)存在著多種抗氧化酶系，常見的有谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)，在這個體系中GSH-Px能催化GSH，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物。此外，CAT可以清除H2O2，SOD可以清除O2－，從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。本研究結(jié)果顯示，在白楊素干預(yù)后，大鼠腦組織中T-AOC、CAT、GSH-Px、SOD和GSH活力明顯升高，而氧化性氧化系統(tǒng)指標H2O2和MDA含量明顯降低，提示白楊素可以通過抑制氧化應(yīng)激來保護腦組織缺血性損傷。

自噬是一種存在于真核生物中、在進化上高度保守的細胞自清除和再循環(huán)機制，自噬參與CI/RI的發(fā)生、發(fā)展過程［16］。研究顯示，白楊素對機體內(nèi)的自噬具有抑制作用［6］。Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白被認為是自噬形成的標記性蛋白。Beclin1介導自噬的啟動階段及自噬體的形成，并調(diào)節(jié)其他自噬蛋白在自噬前體膜的定位［17］。LC3-Ⅱ是一種定位于前體自噬泡和自噬泡膜表面的組織蛋白，參與自噬體的形成［18］。在本研究中，白楊素治療明顯降低了CI/RI誘導的大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達的升高。

Nrf2是細胞內(nèi)重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，在機體的抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；HO-1是機體重要的內(nèi)源性保護酶系之一，也是細胞對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分，Nrf2的激活可以促進HO-1的表達［19］。研究表明，Nrf2參與CI/RI損傷引起的氧化應(yīng)激過程［20-22］。在本研究中，Model組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1的蛋白水平均升高，白楊素干預(yù)后進一步提升了Nrf2和HO-1的蛋白表達水平，表明白楊素干預(yù)對CI/RI大鼠腦組織中Nrf2/HO-1通路蛋白表達具有激活作用。

綜上所述，白楊素治療可抑制CI/RI損傷引起的腦組織損傷以及機體氧化應(yīng)激和細胞過度自噬，其潛在機制可能與白楊素對Nrf2/HO-1通路的激活有關(guān)。但由于有限的實驗條件和樣本，本研究具有一定的局限性，更確切的機制還需要更進一步的研究。

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（收稿日期：2021-05-31）

（本文編輯鄒麗）