摘要目的：探討circRNA泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白2（circ_UQCRC2）靶向miR-532-5p對缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響。方法：體外培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，分為對照組、H/R組、H/R＋si-NC組、H/R＋si-circ_UQCRC2組、H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組、H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-532-5p組。實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（qRT-PCR）法檢測細(xì)胞中circ_UQCRC2和miR-532-5p表達(dá)，比色法檢測乳酸脫氫酶（LDH）漏出量、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X（Bax）蛋白表達(dá)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證circ_UQCRC2和miR-532-5p的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果：與對照組比較，H/R組H9c2細(xì)胞中circ_UQCRC2表達(dá)、MDA含量、LDH漏出量、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高，miR-532-5p表達(dá)、SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與H/R＋si-NC組比較，H/R＋si-circ_UQCRC2組H9c2細(xì)胞中circ_UQCRC2表達(dá)、LDH漏出量、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)降低，miR-532-5p表達(dá)、SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組比較，H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-532-5p組H9c2細(xì)胞中MDA含量、LDH漏出量、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高，miR-532-5p表達(dá)、SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。circ_UQCRC2靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-532-5p。結(jié)論：下調(diào)circ_UQCRC2可抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向負(fù)調(diào)控miR-532-5p有關(guān)。

關(guān)鍵詞缺氧/復(fù)氧；氧化應(yīng)激；心肌細(xì)胞；circRNA泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白2；miR-532-5p；細(xì)胞凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.010

心肌梗死是致死率較高的心血管疾病，其治療主要是通過溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入等方法恢復(fù)血流供應(yīng)［1］。然而，在血流恢復(fù)的同時，過量的活性氧可介導(dǎo)心肌細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加快心肌損傷，即發(fā)生心肌缺血/再灌注（I/R）損傷［2］。因此，探究影響心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的分子機(jī)制并抑制心肌I/R損傷的發(fā)生對改善心肌梗死病人預(yù)后十分重要。circ_UQCRC2是一種環(huán)狀RNA（circRNA），研究顯示，circRNA泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白2（circ_UQCRC2）在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)circ_UQCRC2可通過靶向微小RNA-495-3p（miR-495-3p）/髓樣分化因子88（MYD88）軸抑制LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激，減輕16HBE細(xì)胞損傷［3］；肺炎病人血清及LPS處理的人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）中circ_UQCRC2表達(dá)上調(diào)，沉默circ_UQCRC2通過靶向微小RNA-326（miR-326）/程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）軸減輕了LPS誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞損傷，circ_UQCRC2可作為肺炎治療的分子靶點(diǎn)［4］。Starbase在線軟件預(yù)測顯示，circ_UQCRC2可能發(fā)揮miR-532-5p分子海綿作用。研究顯示，miR-532-5p在缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2中表達(dá)降低，miR-532-5p靶向抑制SRY相關(guān)高遷移率族蛋白框8（Sox8）可減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減弱心肌細(xì)胞損傷，miR-532-5p可作為心肌I/R損傷的治療靶點(diǎn)［5］。本研究建立H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷模型，旨在探討circ_UQCRC2靶向調(diào)控miR-532-5p對H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器

大鼠心肌H9c2細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒、雙熒光素酶活性試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；LipofectamineTM 2000試劑（美國Invitrogen公司）；引物序列、circ_UQCRC2小干擾RNA（si-circ_UQCRC2）及陰性對照序列（si-NC）、circ_UQCRC2野生型和突變型熒光素酶報告基因載體（wt-circ_UQCRC2、mut-circ_UQCRC2）、miR-532-5p模擬物（mimics）和抑制劑（anti-miR-532-5p）、抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）及模擬對照序列（miR-NC）（上海生工生物工程有限公司）；兔源一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（英國Abcam公司）。Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)）；ABI Prism 7500型實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司生產(chǎn)）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和H/R模型建立

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，置于常規(guī)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)［6］方法建立H/R模型：將H9c2細(xì)胞用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于常規(guī)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，加預(yù)先在缺氧培養(yǎng)箱（CO2體積分?jǐn)?shù)5%、N2體積分?jǐn)?shù)95 %）中飽和的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。然后更換為含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于常規(guī)CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧6 h。

1.3qRT-PCR檢測circ_UQCRC2和miR-532-5p表達(dá)

于6孔板中培養(yǎng)H9c2細(xì)胞（1.0×106個/孔），分為對照組和H/R組。H/R組細(xì)胞建立H/R模型，對照組常規(guī)培養(yǎng)相同時間。收集各組細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。2－△△Ct法計(jì)算circ_UQCRC2、miR-532-5p表達(dá)量。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

于6孔板中接種H9c2細(xì)胞（1.0×106個/孔），培養(yǎng)24 h，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_UQCRC2、共轉(zhuǎn)染si-circ_UQCRC2與anti-miR-NC、si-circ_UQCRC2與anti-miR-532-5p至細(xì)胞中，收集各組細(xì)胞，檢測細(xì)胞中circ_UQCRC2或miR-532-5p表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后，將細(xì)胞重新接種至6孔板中，均進(jìn)行H/R處理，并依次作為H/R＋si-NC組、H/R＋si-circ_UQCRC2組、H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組和H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-532-5p組。同時于6孔板中接種未轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞，設(shè)置對照組和H/R組。處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞。

1.5比色法測定LDH漏出量、MDA含量及SOD活性

細(xì)胞離心取上清液，利用LDH試劑盒檢測LDH含量。向收集細(xì)胞中加裂解液，充分裂解后離心取上清液，利用MDA和SOD試劑盒檢測MDA含量及SOD活性。

1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

將收集的各組細(xì)胞用PBS清洗后，加500 μL結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，加10 μL V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），再加5 μL 碘化丙啶（PI），避光放置25 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.7蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞用PBS清洗后，加RIPA試劑裂解，檢測蛋白樣品濃度后，取適量蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對其分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，用Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，再用山羊抗兔二抗（1∶2 000）37 ℃孵育1 h。加顯影液顯影，曝光拍照，ImageJ軟件分析Bax、Bcl-2表達(dá)量。

1.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

于6孔板中培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24 h，用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-532-5p mimic與wt-circ_UQCRC2或mut-circ_UQCRC2。轉(zhuǎn)染后，棄培養(yǎng)液，裂解液細(xì)胞，離心取20 μL上清液，加螢火蟲或海腎熒光素酶反應(yīng)工作液，對螢火蟲與海腎的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，circ_UQCRC2和miR-532-5p表達(dá)量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；LDA漏出量、MDA含量、SOD活性、細(xì)胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1circ_UQCRC2和miR-532-5p在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá)

與對照組比較，H/R組H9c2細(xì)胞中circ_UQCRC2表達(dá)量升高（3.45±0.12與1.00±0.00，t＝61.250，P＜0.05）；miR-532-5p表達(dá)量降低（0.40±0.05與1.00±0.00，t＝－36.000，P＜0.05）。

2.2轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證

與si-NC組比較，circ_UQCRC2組H9c2細(xì)胞中circ_UQCRC2的表達(dá)量降低（0.20±0.03與1.00±0.00，t＝－80.000，P＜0.05），說明circ_UQCRC2組H9c2細(xì)胞中circ_UQCRC2較si-NC組被下調(diào)。與si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組比較，si-circ_UQCRC2＋anti-miR-532-5p組H9c2細(xì)胞中miR-532-5p的表達(dá)量降低（0.43±0.04與1.00±0.00，t＝－42.750，P＜0.05），說明si-circ_UQCRC2＋anti-miR-532-5p組H9c2細(xì)胞中miR-532-5p較si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組被下調(diào)。

2.3circ_UQCRC2和miR-532-5p對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激的影響

與對照組比較，H/R組SOD活性降低，MDA含量和LDH漏出量升高（P＜0.05）。與H/R＋si-NC組比較，H/R＋si-circ_UQCRC2組SOD活性升高，MDA含量和LDH漏出量降低（P＜0.05）。與H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組比較，H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-532-5p組SOD活性降低，MDA含量和LDH漏出量升高（P＜0.05）。H/R組與H/R＋si-NC組、H/R＋si-circ_UQCRC2組與H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組比較，上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.4circ_UQCRC2和miR-532-5p對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響

與對照組比較，H/R組H9c2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與H/R＋si-NC組比較，H/R＋si-circ_UQCRC2組H9c2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組比較，H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-532-5p組H9c2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。H/R組與H/R＋si-NC組、H/R＋si-circ_UQCRC2組與H/R＋si-circ_UQCRC2＋anti-miR-NC組比較，上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1、圖2和表3。

2.5circ_UQCRC2靶向調(diào)控miR-532-5p

Starbase在線預(yù)測顯示，circ_UQCRC2與miR-532-5p的結(jié)合位點(diǎn)見圖3。與miR-NC和wt-circ_UQCRC2共轉(zhuǎn)染組比較，miR-532-5p mimics和wt-circ_UQCRC2共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（0.43±0.05與1.01±0.07，t＝－20.227，P＜0.05）；與miR-NC和mut-circ_UQCRC2共轉(zhuǎn)染組比較，miR-532-5p mimics和mut-circ_UQCRC2共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.96±0.06與0.99±0.06，t＝－1.061，P＝0.305）。此外，與si-NC組比較，circ_UQCRC2組H9c2細(xì)胞中miR-532-5p的表達(dá)量升高（4.19±0.08與1.00±0.00，t＝119.625，P＜0.05），說明下調(diào)circ_UQCRC2促進(jìn)H9c2細(xì)胞中miR-532-5p的表達(dá)。

3討論

circRNA和miRNA是兩類非編碼RNA，且circRNA能夠調(diào)控miRNA的靶基因發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用［7］。隨著對circRNA和miRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)circRNA/miRNA/靶基因這一調(diào)控通絡(luò)在心肌損傷等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［8-9］。例如，環(huán)狀RNA同源域相互作用蛋白激酶3（circHIPK3）在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)增加，其通過靶向miR-20b-5p上調(diào)自噬相關(guān)因子7（ATG7）的表達(dá)促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬和凋亡，加劇心肌I/R損傷［8］；環(huán)狀RNA UBXN7（circUBXN7）在急性心肌梗死病人及H/R處理的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其過表達(dá)可減輕H/R介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及炎性因子分泌，這與過表達(dá)circUBXN7通過靶向miR-622上調(diào)細(xì)胞中骨髓細(xì)胞白血病1（MCL1）的表達(dá)有關(guān)［9］。以上研究表明circRNA為心肌梗死的治療提供了潛在新靶點(diǎn)。

作為一種circRNA，circ_UQCRC2對I/R損傷影響的報道較少。過度氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞損傷的主要原因之一［10］。本研究結(jié)果顯示，circ_UQCRC2在H/R處理的H9c2細(xì)胞中表達(dá)升高，下調(diào)circ_UQCRC2降低了H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH漏出量及細(xì)胞中MDA含量，提高了SOD活性，說明下調(diào)circ_UQCRC2可抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，過度氧化應(yīng)激可進(jìn)一步造成心肌細(xì)胞凋亡，Bax發(fā)揮促凋亡作用，而Bcl-2則起抗凋亡作用［11-12］。本研究顯示，下調(diào)circ_UQCRC2降低了H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)，增加了Bcl-2蛋白表達(dá)，說明下調(diào)circ_UQCRC2可抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，提示下調(diào)circ_UQCRC2可減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷，circ_UQCRC2有可能是心肌I/R損傷的潛在分子靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步探究下調(diào)circ_UQCRC2抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激和凋亡的分子機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對circ_UQCRC2的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，并證實(shí)了circ_UQCRC2可靶向負(fù)調(diào)控miR-532-5p，這與本研究H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中circ_UQCRC2表達(dá)升高而miR-532-5p表達(dá)降低的結(jié)果一致。既往研究顯示，miR-532-5p對減輕心肌損傷及腦損傷具有積極作用［13-15］。Han等［13］研究顯示，miR-532-5p在心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-532-5p可通過增加心肌細(xì)胞活力及減少細(xì)胞凋亡減輕心肌損傷。Lu等［14］研究顯示，miR-532-5p在短暫性大腦中動脈閉塞（MCAO）小鼠腦組織及體外氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12損傷模型中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-532-5p可抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡及LDH漏出量，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。Shi等［15］研究顯示，上調(diào)miR-532-5p可降低大腦中動脈閉塞大鼠腦梗死體積，減輕腦水腫及神經(jīng)元凋亡。在本研究中，敲低circ_UQCRC2可上調(diào)miR-532-5p表達(dá)，且下調(diào)miR-532-5p可減弱下調(diào)miR-532-5p對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激和凋亡的抑制作用，提示circ_UQCRC2可能通過靶向負(fù)調(diào)控miR-532-5p影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激和凋亡。

綜上所述，心肌細(xì)胞H9c2經(jīng)H/R處理后，細(xì)胞中circ_UQCRC2表達(dá)升高，而miR-532-5p表達(dá)降低；下調(diào)circ_UQCRC2抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，這可能與下調(diào)circ_UQCRC2引起細(xì)胞中miR-532-5p表達(dá)上調(diào)有關(guān)，circ_UQCRC2有可能成為減輕心肌I/R損傷的分子靶點(diǎn)。本研究也存在不足之處，circ_UQCRC2作用的miR-532-5p的靶基因還未探究，且尚需進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證circ_UQCRC2/miR-532-5p軸對心肌I/R損傷的影響。

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（收稿日期：2022-05-23）

（本文編輯鄒麗）