樊哲儒 王龍 王晞 周芳

[基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81772044）；湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目（2021KFY035）

通信作者：王龍，E-mail：wanglongwhu@163.com]

【摘要】目的? 探究腺相關(guān)病毒不同轉(zhuǎn)染策略構(gòu)建大鼠心臟光遺傳學(xué)模型的可行性與有效性。方法? 20只SD大鼠，隨機(jī)分為4組：心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組、正常對(duì)照組，每組5只，分別心肌注射、心包注射、心外膜滴涂rAAV9-CAG-hChR2（H134R）-eYFP，正常對(duì)照組只開(kāi)胸。造模4周后，超聲測(cè)量4組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率；記錄體表心電圖，測(cè)量RR間期、PR間期和QRS時(shí)限。開(kāi)胸進(jìn)行473 nm波長(zhǎng)藍(lán)光照明實(shí)驗(yàn)，根據(jù)光輸出信號(hào)與心電圖判斷心臟節(jié)律是否被光脈沖奪獲。對(duì)心臟組織石蠟切片進(jìn)行HE染色和熒光觀察。結(jié)果? 心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組大鼠與正常對(duì)照組大鼠相比，心電參數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。用一定頻率和功率的473 nm藍(lán)光照射心肌注射部位或心臟，能奪獲心肌注射組和心包注射組心臟的節(jié)律，但不能奪獲心外膜滴涂組。HE染色顯示心肌注射組注射部位心肌纖維排列紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。熒光顯示心肌注射組、心包注射組、心包滴涂組心室切片均有ChR2（H134R）轉(zhuǎn)染。結(jié)論? 心包注射途徑能有效構(gòu)建大鼠心臟光遺傳學(xué)模型。

【關(guān)鍵詞】光遺傳學(xué)；腺相關(guān)病毒；光敏蛋白質(zhì)；光起搏；心包注射

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2023.12.000

Different Transfection Strategies of Adeno-Associated Virus Applied

to Cardiac Optogenetics

FAN Zheru1，WANG Long1，WANG Xi2，ZHOU Fang1

（1.Department of Anesthesiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China；2.Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Cardiovascular Research Institute of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Wuhan 430060，Hubei，China）

【Abstract】Objective? To investigate the feasibility and effectiveness of different transfection strategies of adeno-associated viruses to construct a rat cardiac optogenetic model. Methods? A total of 20 SD rats were purchased and randomly divided into four groups：myocardial injection group，pericardial injection group，epicardial drip coating group and normal control group. The rats （n＝5） were injected with rAAV9-CAG-hChR2（H134R）-eYFP by myocardial injection，pericardial injection and epicardial drip coating respectively. After Four weeks，left ventricular ejection fractions （LVEF） and left ventricular fractional shortening （LVFS） of all rats were measured by ultrasound;record the body surface ECG to measure the RR interval，PR interval and QRS wave time frame. Open-chest light experiments with 473 nm blue light were performed to determine whether the heart rhythm was captured by the light pulse based on the light output signal and the body surface ECG. Results? The rats in the myocardial injection group，pericardial injection group and epicardial drip coating group ，compared with the rats in the normal control group，showed no significant differences in ECG parameters （P＞0.05） and no significant differences in LVEF and LVFS （P＞0.05）. The rhythm of myocardial injection and pericardial injection groups could be captured by irradiating the myocardial injection site or heart with 473 nm blue light of certain frequency and power，but not the epicardial drip coating group. HE staining showed disorganized myocardial fiber arrangement and inflammatory cell infiltration at the injection site in the myocardial injection group. Fluorescence showed ChR2 （H134R） transfection in ventricular sections of the myocardial injection group，pericardial injection group，and pericardial drip coating group. Conclusion? The pericardial injection route can effectively construct cardiac optogenetics model.

【Key words】Optogenetics;Adeno-associated virus;Light-sensitive protein;Optical pacing;Pericardial injection

光遺傳學(xué)是利用遺傳技術(shù)，將光敏感元件導(dǎo)入細(xì)胞或組織，與光學(xué)技術(shù)結(jié)合[1]，對(duì)生物特定功能進(jìn)行研究。2005年，神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域首次報(bào)道光遺傳學(xué)應(yīng)用，Boyden等[2]將光遺傳學(xué)應(yīng)用于神經(jīng)回路。2010年Bruegmann等[3]將帶有視紫紅質(zhì)通道蛋白-2（channelrhodopsin-2，ChR2）的病毒結(jié)合到小鼠胚胎干細(xì)胞中，用于證明體外光學(xué)起搏。自此光遺傳學(xué)應(yīng)用于心臟[4-6]，開(kāi)啟心臟光遺傳學(xué)新興研究方向[3]。將ChR2[1]特定表達(dá)于心肌細(xì)胞，特定波長(zhǎng)藍(lán)光照射導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，引發(fā)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位，使光遺傳學(xué)成為一種心臟起搏、同步化、終止心律失常的新途徑，有望實(shí)現(xiàn)無(wú)電擊和院外轉(zhuǎn)復(fù)。藥物、電子起搏器等有相關(guān)免疫反應(yīng)、感染風(fēng)險(xiǎn)、設(shè)備故障和促心律失常的局限性，這些問(wèn)題可通過(guò)光遺傳技術(shù)替代解決。本研究利用載有ChR2（H134R）目的基因的重組腺相關(guān)病毒血清型9（rAAV9）[7]，通過(guò)心肌注射、心包注射、心外膜滴涂3種途徑，將ChR2表達(dá)于大鼠心肌細(xì)胞，給予473 nm波長(zhǎng)藍(lán)光，探討不同途徑構(gòu)建大鼠光遺傳模型的可行性、安全性和有效性。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體重（120±10）g，購(gòu)自武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為4組：心肌注射組（n＝5），心包注射組（n＝5），心外膜滴涂組（n＝5），正常對(duì)照組（n＝5）。攜帶eYFP熒光的載有ChR2（H134R）的rAAV9購(gòu)于武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司。外科用封合劑購(gòu)于百特醫(yī)療用品貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2? 光遺傳模型制備

所有動(dòng)物均在20～25 ℃的SPF級(jí)環(huán)境內(nèi)恒溫飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食8 h，予大鼠腹腔注射60 mg/kg的3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。行氣管插管術(shù)，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，正壓通氣，潮氣量10～15 mL，呼吸頻率70次/分。開(kāi)胸后用擴(kuò)胸器固定，充分暴露其心室游離壁的同時(shí)避免損傷肺葉。心肌注射組開(kāi)胸術(shù)后，用30 G胰島素注射器將rAAV9（60×1012μL）進(jìn)行心肌注射。心包注射組開(kāi)胸術(shù)后，用5-0線穿過(guò)心包膜，將心包膜提起與心肌分離出間隙，通過(guò)間隙用30 G胰島素注射器將rAAV9（60×1012μL ）注射入心包腔內(nèi)，注射完畢后棉簽輕輕按壓注射點(diǎn)避免病毒載體隨心臟跳動(dòng)漏出心包外。心外膜滴涂組在開(kāi)胸術(shù)后，用自制固定器在心室游離壁上定位，將相同容量的rAAV9載體滴入固定器內(nèi)，噴入適量外科用封合劑，移除固定器，待封合劑固定膨脹后關(guān)胸。術(shù)后逐層縫合關(guān)胸，正常對(duì)照組大鼠只開(kāi)胸。4組大鼠同等條件下給予常規(guī)飼料及水飼養(yǎng)4周。

1.3? 心臟超聲檢查

光遺傳造模4周后第1天，用超聲儀器（Vinno V6）評(píng)估大鼠心臟功能。4組大鼠腹部注射3%戊巴比妥鈉（10～20 mg/kg）麻醉，保留大鼠自主呼吸，胸部脫毛后仰臥位固定行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查。測(cè)量大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左室短軸縮短率（Left ventricular fractional shortening rate，LVFS），連續(xù)3次后計(jì)算平均值。檢查完成后大鼠充分保暖直至清醒。

1.4? 體表心電圖記錄與光起搏效應(yīng)評(píng)價(jià)

光遺傳造模4周后第2～5天，4組大鼠進(jìn)行光起搏實(shí)驗(yàn)，記錄體表心電圖。大鼠四肢用針刺電極連接PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄Ⅱ?qū)?lián)體表心電圖，利用LabChart 8.0分析RR間期、PR間期和QRS時(shí)限。

設(shè)置473 nm藍(lán)光激光器的脈沖寬度為20 ms，連續(xù)20個(gè)脈沖，使用不同光照頻率與光照功率（功率范圍0.02～65.50 mW）[8]照射心臟（緊貼心臟表面），根據(jù)同步記錄的光輸出信號(hào)與體表心電圖判斷心臟節(jié)律是否被光脈沖奪獲。

1.5? HE染色和eYFP熒光觀察

完成光照實(shí)驗(yàn)的大鼠取心肌組織，生理鹽水沖洗干凈，4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片。用蘇木素和伊紅染液進(jìn)行HE染色，觀察心肌形態(tài)學(xué)變化。用熒光顯微鏡觀察eYFP的綠色熒光，以確定病毒的轉(zhuǎn)染情況。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2? 結(jié)果

2.1? 心電指標(biāo)比較

根據(jù)LabChart 8.0記錄的Ⅱ?qū)?lián)心電圖，測(cè)量4組大鼠心電圖相關(guān)參數(shù)。心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組大鼠與正常對(duì)照組大鼠相比，RR間期、PR間期及QRS時(shí)限無(wú)顯著差異（圖1）。

2.2? 心功能指標(biāo)比較

心臟超聲結(jié)果顯示，心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組大鼠與正常對(duì)照組大鼠相比，LVEF及LVFS無(wú)顯著差異（圖2）。心肌注射組的LVEF及LVFS雖略有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3? 光起搏有效性評(píng)價(jià)

病毒轉(zhuǎn)染4周后，使用20個(gè)脈沖寬度20 ms的473 nm藍(lán)光照射大鼠心臟或注射部位，達(dá)到一定脈沖頻率與光照功率范圍后能奪獲心肌注射組、心包注射組大鼠心臟的節(jié)律，但不能奪獲心外膜滴涂組和正常對(duì)照組心臟的節(jié)律（圖3）。

2.4? 心肌HE染色

心包注射組和心外膜滴涂組大鼠心肌切片之間HE染色無(wú)明顯區(qū)別，心肌纖維排列規(guī)則，細(xì)胞膜完整，輪廓清晰，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。心肌注射組注射部位（右心室）心肌切片顯示心肌纖維排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4）。

2.5? eYFP的熒光表達(dá)

熒光顯微鏡下觀察到3組大鼠心房切片偶見(jiàn)綠色熒光。心包注射組心室切片、心外膜滴涂組心外膜處心室切片顯示綠色熒光，心肌注射組注射部位心室切片顯示綠色熒光（圖5）。

3? 討論

心臟光遺傳學(xué)是一種新興的操作和技術(shù)，將光學(xué)與遺傳學(xué)結(jié)合，利用基因編輯技術(shù)，在心肌細(xì)胞插入光敏感生物元件，通過(guò)光電流引發(fā)心肌細(xì)胞電活動(dòng)。ChR2是一種快速門(mén)控非選擇性光敏陽(yáng)離子通道，來(lái)源于萊茵衣藻，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定安全地表達(dá)，主要傳導(dǎo)Na+和K+，ChR2激活引發(fā)向內(nèi)電流和細(xì)胞膜去極化。心臟光遺傳學(xué)常使用ChR2（H134R），是ChR2的第一個(gè)突變體，與ChR2相比脫敏性降低，可產(chǎn)生兩倍光電流，雖然通道開(kāi)關(guān)速度減慢，但仍在毫秒水平[9]。AAV是一種單鏈DNA病毒，長(zhǎng)度約為18～25 nm。根據(jù)病毒衣殼蛋白氨基酸序列，AAV分為多個(gè)血清型。其中AAV9與其他血清型相比，具有心肌細(xì)胞趨向性及心肌轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)[7，10]，適用于構(gòu)建心臟光遺傳學(xué)模型。既往已有研究證明可通過(guò)靜脈注射途徑構(gòu)建心臟光遺傳模型，但與構(gòu)建模型的途徑相比，靜脈注射所需的大劑量[11]限制了靜脈注射的發(fā)展。

本研究采用了三種方式構(gòu)建大鼠心臟光遺傳模型，分析其對(duì)心臟組織分布和轉(zhuǎn)導(dǎo)效果的影響，評(píng)估各方式的可行性與安全性。心肌注射可在注射部位局部實(shí)現(xiàn)高效的心肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)1∶1心臟起搏，但與其他途徑相比，心肌注射方式產(chǎn)生強(qiáng)烈的心肌內(nèi)炎癥和心肌細(xì)胞壞死[12]，更易導(dǎo)致心室顫動(dòng)[13]。水凝膠已用于藥物輸送系統(tǒng)[14]，實(shí)現(xiàn)皮膚、骨骼、血管等組織的修復(fù)和再生。本研究中使用的外科用封合劑，是一種合成水凝膠，已成熟應(yīng)用于臨床。但由于本實(shí)驗(yàn)一是，未對(duì)rAAV9與外科用封合劑的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，rAAV9轉(zhuǎn)染效率是否受影響有待研究；二是，操作過(guò)程中，液體在心外膜表面的流動(dòng)性可能導(dǎo)致病毒的流失，實(shí)際轉(zhuǎn)染量低于預(yù)期，結(jié)果中熒光雖提示心外膜滴涂組大鼠心外膜處有病毒轉(zhuǎn)染，但未能有效傳遞基因以實(shí)現(xiàn)心臟起搏。心包腔是天然的包膜，心包注射可將rAAV9限制在心包內(nèi)，延長(zhǎng)病毒與心肌接觸時(shí)間，增大接觸面積，實(shí)現(xiàn)病毒的靶向傳遞，減少病毒對(duì)其他組織可能產(chǎn)生的副作用。此外，心包注射已應(yīng)用于藥物、質(zhì)粒、細(xì)胞、生物制劑的傳輸[13]，顯示心包注射在治療心律失常、血管損傷和心肌梗死中的潛力。本研究中，心包注射不僅對(duì)大鼠心臟的電生理與功能影響較小，且能實(shí)現(xiàn)1∶1心臟起搏。

雖然本實(shí)驗(yàn)表明心包途徑是一種有效的傳遞基因的方式，但仍具有局限性。首先，心包注射組大鼠心房未能有效表達(dá)ChR2，實(shí)現(xiàn)心房奪獲。其次，病毒在心臟組織的分布與心包內(nèi)病毒的清除率密切相關(guān)，注射入心包的病毒能否在清除前轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞有待進(jìn)一步研究。另外，病毒量的選擇也很重要，如何達(dá)到最大效率轉(zhuǎn)染且不至于心臟壓塞還有待探討。最后，本研究所有的結(jié)果是在嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到的，嚙齒動(dòng)物與人類之間有不同的心血管解剖結(jié)構(gòu)和生理[15]，尚需在與人類有類似結(jié)構(gòu)或生理的大型動(dòng)物（如犬、豬）中進(jìn)行進(jìn)一步研究，提供臨床轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)。

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收稿日期：2022-12-22