白學慧 ，蕭自位 ，馬關(guān)潤 ，羅 琴 ，陳振佳 ，李錦紅 *

（1.云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所，云南瑞麗 678600；2.中國咖啡工程研究中心，云南芒市 678400）

咖啡是世界上重要的飲料作物和熱帶經(jīng)濟作物，云南熱區(qū)咖啡適種區(qū)面積約40 萬hm2，截至2021 年底，咖啡種植面積9.29 萬hm2、農(nóng)業(yè)產(chǎn)值26.04 億元，綜合產(chǎn)值339.25 億元。云南省咖啡面積、產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)產(chǎn)值均占全國的98%以上?？Х犬a(chǎn)業(yè)是云南省打造世界一流“綠色食品牌”的高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一。 由咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrixBerk. & Br.）引起的咖啡銹病是咖啡生產(chǎn)中最重要的病害，在世界各主要咖啡產(chǎn)區(qū)均有不同程度發(fā)生，并以流行猛烈、傳播迅速、損失慘重而著稱［1］，在適宜的氣候條件下，咖啡銹病可以導致葉片損失達50%，漿果損失達70%［2］?？Х蠕P病在中美洲及哥倫比亞、秘魯和厄瓜多爾發(fā)生嚴重并廣泛流行，造成了很大危害［3-5］?？Х蠕P病對云南小粒種咖啡的產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大，是限制咖啡產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素［6］，種植咖啡抗病品種是控制該病害最為經(jīng)濟、有效和安全的措施［7］。

弄清病原菌生理小種分化情況是開展抗銹育種的前提和基礎(chǔ)。在咖啡種植國當中，印度最先對咖啡銹病進行研究，印度學者Mayne 首次報道印度存在咖啡銹菌生理分化現(xiàn)象，鑒定出2 個小種［8］，并于1939 年鑒定出另外兩個生理小種（race3 和race4），其研究成果為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)［9］。國際咖啡銹病研究中心（CIFC）經(jīng)過50多年的研究，對全世界46 個咖啡種植國的咖啡銹菌樣品進行小種鑒定，已發(fā)現(xiàn)小種49 個，分別用羅馬數(shù)字 I，II，III 等表示［10］。我國陳振佳等 1998年報道云南咖啡種植區(qū)有 I（v2，v5），II（v5），XV（v4，v5）和 XXIV（v2，v4，v5）4 個生理小種［11］。白學慧等2018 年報道云南咖啡植區(qū)有VIII（v2，v3，v5）、XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，v5，7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXVII（v2，v5，v6，v7，v9）、XLI（v2，v5，v8）、XLII（v2，v5，v7，v8 或 v2，v5，v7，v8，v9），New race（v2，v5，v6，v7），New race（v1，v2，v5，v7 或 v1，v2，v5，v7，v9），New race（v1，v5，v7 或 v1，v5，v7，v9）9 個生理小種［12］。

Bettencourt 等［13］1985 年報道，咖啡種群有抗銹病基因9 個，用SH1～SH9 表示，銹菌小種的毒力基因也有9 個，用v1～v9 表示，且小種的毒性基因與咖啡種群的抗病基因?qū)?yīng)。Van der Vossen 等［14］2005 年報道由于世界不同咖啡種植區(qū)新的銹菌生理小種不斷出現(xiàn)，咖啡抗銹基因SH1～SH9 已經(jīng)被陸續(xù)攻克。XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，5，7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXVII（v2，v5，v6，v7，v9）、XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）等生理小種的出現(xiàn)，使抗病品種卡蒂姆7963 先后在印度、巴西、肯尼亞、坦桑尼亞、泰國、印度尼西亞、菲律賓、哥倫比亞和中國等咖啡種植區(qū)逐漸喪失抗銹性［15-20］，由于咖啡銹菌群體遺傳變異，培育具咖啡銹病持久抗病性的抗病品種一直是咖啡抗性育種的挑戰(zhàn)。掌握咖啡銹菌生理小種分化及地理分布對該病的有效防治具有重要意義。本研究利用19 個國際通用的咖啡銹菌鑒別寄主，采用人工活體接種的方式，對2017—2019 年從云南咖啡植區(qū)15 個縣（市）采集的銹菌樣本進行生理小種鑒定，以期為云南咖啡品種合理布局及咖啡育種策略的調(diào)整提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

菌株樣本主要為2017/2018 年度、2018/2019 年度、2019/2020 年度從云南15 個縣（市）采集的銹菌孢子，采集地咖啡栽培品種及生態(tài)環(huán)境較具代表性。孢子經(jīng)純化、擴繁、保存了58 份用于生理小種鑒定，其中 2017/2018 年度 24 份、2018/2019 年度25 份、2019/2020 年度9 份。樣本采集信息詳見表1。

1.1.2 鑒別寄主

采用19 個通用的鑒別寄主，包括15 個小粒咖啡（Coffea arabica）或四倍體雜交咖啡（Tetrapliod interspecific hybrids），4 個 二 倍 體 咖 啡（Coffeaspp.），品種所含抗病基因詳見表2。

表2 咖啡銹菌小種鑒定所用鑒別寄主及其攜帶抗病基因

1.2 鑒定方法

鑒定在云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所溫室進行，菌株的保存、擴繁和鑒定方法按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（NY/T3331—2018）《熱帶作物品種資源抗病蟲鑒定技術(shù)規(guī)程咖啡銹病》中描述的方法進行［21］。將采集的銹菌樣本用解剖刀輕輕刮下單個夏孢子堆，接種在鑒別品種Matari（849/1）幼嫩的新葉背面，用毛刷輕輕涂抹均勻，并輕輕噴施水霧，至有水膜產(chǎn)生為止，然后套塑料袋保濕遮光48 h。約30 d 后收集夏孢子并接種至不同鑒別品種，接種后30～45 d 開始調(diào)查，間隔1 周調(diào)查2 次，每個銹菌樣本重復3 次。

1.3 抗病性分級標準

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（NY/T3331-2018）《熱帶作物品種資源抗病蟲鑒定技術(shù)規(guī)程 咖啡銹病》的分級標準［21］，按10 級劃分（表 3，圖 1）。其中 0～3 級為抗?。≧）、4～5 級為中抗（MR）、6～7 級為中感（MS）、8～9 級為感病（S）。

圖1 咖啡銹病不同病級癥狀圖

表3 咖啡銹病病情分級標準

2 結(jié)果與分析

2.1 銹菌生理小種類型及地理分布

根據(jù)咖啡銹菌樣本與鑒別接種的抗感反應(yīng)，鑒定出12 個生理小種（表4），分別為I（v2，v5）、II（v5）、VIII（v2，v3，v5）、XVII（v1，v2，v5）、XXIV（v2，v4，v5）、XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，v5，v7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXV（v2，v4，v5，v7，v9）、XXXVIII（v2，v5，v6，v7，v9）、XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）、XLI（v2，v5，v8）和 XLII（v2，v5，v7，v8 或 v2，v5，v7，v8，v9）。其中：云南德宏植區(qū)有 7 個，分別為 I、VIII、XVII、XXIV、XXXIV、XXXV 和 XLII 型 小 種；大 理 1 個，僅 有 II 型小 種 ；普洱 6 個，分別為 I、II、XXXIV、XXXVII、XXXIX 及XLII 型小種；保山 5 個，分別為 I、II、XXXIII、XXXIV 及 XLII 型 小種 ；臨 滄 5 個 ，分 別為 II、XXXIII、XXXIV、XLI 及 XLII 型小種（表1，表5）。

表1 咖啡銹菌樣本采集點及寄主

表4 不同銹菌小種在鑒別寄主上的抗病類型

表5 銹菌小種類型及地理分布

2.2 銹菌生理小種出現(xiàn)頻率及毒力基因種類

本次研究中對58 份銹菌樣本進行鑒定，共鑒定出12 個生理小種。其中，XXXIV 型生理小種為優(yōu)勢小種，占樣本的24.14%；I 型和XXXIII 型小種均占樣本的18.97%；II 占樣本的10.34%；XLII 占樣本的8.62%；XXXVII 和XLI 均占樣本的5.18%；VIII、XVII、XXIV、XXXV 和 XXXIX 分別占樣本的1.72%（表6）。本次鑒定結(jié)果表明，云南咖啡主產(chǎn)區(qū)包含v1～v9 共9 個毒力基因。其中，含單個毒力基因（II 號生理小種）僅占樣本總數(shù)的10.34%，其余均為雙至多個毒力基因（表6）。

從地區(qū)看，德宏地區(qū)共17 個樣本，I 型生理小種7 個，占德宏地區(qū)41.18%，保山地區(qū)19 個樣本，XXXIII 型生理小種 9 個，占保山地區(qū)47.37%。普洱和臨滄差距不大。與2018 年白學慧等的報道相比，新鑒定出6 個生理小種，分別為 I（v2，v5）、II（v5）、XVII（v1，v2，v5）、XXIV（v2，v4，v5）、XXXV（v2，v4，v5，v7，v9）和 XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）［13］。表明云南咖啡主產(chǎn)區(qū)銹菌小種類型呈現(xiàn)增加的趨勢，對抗銹育種提出了新的挑戰(zhàn)。

3 討論

咖啡銹?。℉. vastatrixBerkeley & Broome）對咖啡野生種和栽培種均有危害，對小粒種咖啡（Coffea arabica）的危害最為嚴重。1861年該病害被英國探險隊首次在東非維多利亞湖畔發(fā)現(xiàn)，1868 年在斯里蘭卡首次流行，目前已在全世界咖啡產(chǎn)區(qū)流行。種植抗銹品種是控制咖啡銹病最為經(jīng)濟有效的措施。1875 年起，咖啡研究者在田間尋找抗銹病植株，1927 年在Timor島發(fā)現(xiàn) HDT（C. canphora和C. arabica天然雜交），上世紀50 年代CIFC（葡萄牙咖啡銹病研究中心）以HDT 作為主要抗源與世界各主產(chǎn)國聯(lián)合開展了抗銹咖啡品種的選育［22］。但是，在選育具有抗病性品種的同時，隨之出現(xiàn)的銹菌新型小種逐漸克服了抗病咖啡品種的抗性，使其抗性僅在一定時間及空間內(nèi)有效。如，‘S. 288’主要對II 型小種有抗性，引入云南種植14 年后抗性逐漸喪失?！ǖ倌稢IFC7963’引入云南從推廣到失去抗性僅 9 年時間［23］。Várzea 等［24］2005 年報道咖啡銹菌新小種產(chǎn)生的機制可能源自銹菌變異，Robinson［25］、Vanderplank［26］、Eskes［27］1983 年報道病原菌小種的形成、分布與該地區(qū)栽培品種的抗病基因相關(guān)，新小種是以克服品種抗病性為目的而形成的。本研究鑒定的 I（v2，v5）、II（v5）和 XXIV（v2，v4，v5）生理小種寄主均為鐵皮卡（Typica）、波邦（Bourbon）、卡杜拉（Caturra）等感病品種（無抗源介入），XXXIII（v5，v7 或 v5，v7，v9）、XXXIV（v2，v5，7 或 v2，v5，v7，v9）、XXXV（v2，v4，v5，v7，v9）、XXXVII（v2，v5，v6，v7，v9）、XXXIX（v2，v4，v5，v6，v7，v8，v9）、XLI（v2，v5，v8）和 XLII（v2，v5，v7，v8 或 v2，v5，v7，v8，v9）等生理小種寄主均為卡蒂姆系列（Catimor）品種（有HDT 抗源介入），表明咖啡銹菌生理小種的形成、分布與栽培品種的抗病基因相關(guān)。

本次研究共鑒定出12 個生理小種，和陳振佳等［11］1998 年、白學慧等［12］2018 年的報道相比，云南咖啡植區(qū)新增4 個生理小種，分別為XVII、XXIV、XXXV 和XXXIX。本研究中銹菌包含的毒力基因為 v1～v9，與陳振佳等［11］1998 年的報道相比，增加毒力基因 v1、v3、v6、v8；與白學慧等［12］2018年的報道相比，增加毒力基因v4。綜上，云南咖啡銹菌生理小種的類型處于動態(tài)變化中，銹菌的種類和毒力基因也在不斷增加。這與Van der Vossen 等［14］2005 年報道世界不同咖啡種植區(qū)新型銹菌生理小種不斷出現(xiàn)，咖啡抗銹基因SH1～SH9 已經(jīng)被陸續(xù)攻克的研究也吻合。

我國目前選育和推廣的咖啡抗銹品種的抗源基本都來自HDT。銹病抗源單一，亟待創(chuàng)新、引進新的銹病抗源，并在選育推廣咖啡抗銹品種的過程中拓寬手段和策略。