張雅倫，許苗苗，劉雨蒙，祝巖波，嚴陶陶，王 贊，張 捷

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，國家市場監(jiān)管重點實驗室（特殊食品監(jiān)管技術(shù)） 特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北 石家莊 050071）

沙門氏菌是肉與肉制品中常見的食源性致病菌，常導致感染者胃腸炎、腹瀉，對人類健康產(chǎn)生嚴重危害[1-2]， 其中的腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，SE）無特定宿主，主要通過糞便或灰塵進行氣溶膠傳播，是一種重要的人畜共患病原體[3-4]。近幾年，全球范圍內(nèi)沙門氏菌引起的肉及肉制品食品安全事件頻發(fā)[5]。肉制品在從飼養(yǎng)開始的生產(chǎn)過程中，到向屠宰廠的運輸，或屠宰過程中的處理，均存在被沙門氏菌污染的可能[6]。此外，冷鮮店中的肉還存在沙門氏菌交叉污染的風險，污染程度約增加20%[7-9]。數(shù)據(jù)顯示，我國肉及肉制品中沙門氏菌的檢出率達到1.1%～39.5%[10]。在兩廣、福建和上海地區(qū)零售肉類所采集的399 株沙門氏菌中，17.04%的菌株為腸炎沙門氏菌，檢出率最高[11]。在江蘇[12-13]、上海[14-15]、四川[16]、山東[17]等地所采集的鴨肉及其制品中，沙門氏菌的檢出率為20%～48%。四川省眉山市一學校曾爆發(fā) 沙門氏菌污染豬肉制品導致的食品安全事件，涉及人數(shù)達到386 人[18]。

細菌污染導致的食品安全問題頻發(fā)，使得消費者對肉及肉制品中致病菌的檢測也越來越關(guān)注?？焖佟蚀_鑒定食源性微生物是食品微生物檢驗的一項基本要求。常用的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法雖然作為檢測沙門氏菌的“金標準”，但耗時費力，且靈敏度低，不能滿足食品行業(yè)快速檢測的需求[19]。而后發(fā)展起來的聚合酶鏈式反應(yīng)、環(huán)介導等溫擴增等方法雖然具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，但大多需要昂貴的反應(yīng)儀器，或引物設(shè)計較為復雜，氣溶膠污染嚴重[20-21]。因此，開發(fā)一種快速、準確、操作簡單的檢測肉及肉制品中沙門氏菌的方法具有十分重要的意義。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年來發(fā)展的一種新型分析技術(shù)，具有前處理簡單和高通量的特點[22-23]。MALDI-TOF-MS可以實現(xiàn)對未知微生物的快速鑒定、分型及溯源等[24-26]，已經(jīng)被用于快速檢測和鑒定從鮮食蔬菜中分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌和蠟樣芽孢桿菌，以及對沙門氏菌的分型溯源等[27-29]。目前，基于MALDI-TOF-MS檢測沙門氏菌的質(zhì)控樣品相關(guān)報道很少。本研究利用MALDI-TOF-MS技術(shù)，擬研制即用型腸炎沙門氏菌陽性質(zhì)控樣品，并對其應(yīng)用效果進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸炎沙門氏菌標準菌株（CMCC 50957） 中國食品藥品檢定研究院。

無水乙醇、甲酸、乙腈（均為質(zhì)譜純） 天津科密歐化學試劑有限公司；質(zhì)譜靶標基質(zhì)液 德國布魯克科技有限公司；平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MALDI-TOF/TOF 7090質(zhì)譜儀、MIR-254低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；ME204電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；3K15臺式離心機 德國Sigma 公司；VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀 法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 即用型腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品制備及檢測

1.3.1.1 制備過程

保護劑的制備：在超純水中加入蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白，使其質(zhì)量濃度分別為15、8、5 g/100 mL。

將腸炎沙門氏菌標準菌株劃線接種于PCA培養(yǎng)基，在36 ℃條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，使用無菌棉簽蘸取菌苔置于生理鹽水中，混懸于凍干保護劑中，調(diào)整菌懸液的麥氏濁度至2.5 MCF。然后在西林瓶中放入干燥劑，再加滿液氮，并滴加100 μL菌懸液，放入真空冷凍干燥機。待樣品充分干燥后取出，密封壓蓋冷藏。

1.3.1.2 即用型腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品

制得腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品為白色圓球狀，西林瓶密封良好，干燥劑未變色，水分去除完全，符合要求，可繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

1.3.1.3 計數(shù)方法

取出未開啟的凍干菌球西林瓶，置于室溫下，開啟前用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞。將凍干菌球轉(zhuǎn)移至10 mL無菌水中，再進行10 倍梯度稀釋。將稀釋液接種至PCA培養(yǎng)基，置于36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后進行計數(shù)。

1.3.1.4 MALDI-TOF-MS檢驗

取出未開啟的凍干菌球西林瓶，置于室溫下，用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞并開啟。將菌球轉(zhuǎn)移至離心管后加入100 μL無菌水，振蕩1 min，使其溶解并混勻，12500 r/min離心5 min后棄上清。向所得沉淀中加入100 μL無菌水，重復離心3 次。向最終沉淀中加入50 μL體積分數(shù)為70%的甲酸，振蕩2 min，再加入50 μL乙腈，振蕩2 min，最終制得檢測液。吸取1 μL檢測液的上清滴到靶板上，室溫晾干后覆蓋1 μL基質(zhì)，再次晾干，開始檢測。

在質(zhì)荷比（m/z）2000～20000進行檢測。根據(jù)MALDI-TOF-MS分析得出的特征性質(zhì)譜圖分析腸炎沙門氏菌裂解后特異性蛋白質(zhì)或多肽離子峰，實現(xiàn)對檢測菌株的區(qū)分和鑒定。

1.3.2 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性研究

隨機抽取腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品20 瓶，向每瓶加入1 mL生理鹽水，使凍干樣品充分溶解，使用加樣系統(tǒng)涂布接種于PCA培養(yǎng)基，每個樣品進行2 次平行實驗。置于36 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后對計數(shù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性研究

運輸條件模擬實驗：模擬實驗周期為2 周。將腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品分別放置于37 ℃培養(yǎng)箱和25 ℃搖床中，分別在0、1、3、5、7、14 d取出質(zhì)控樣品，每個實驗條件隨機抽取3 個質(zhì)控樣品，按照1.3.1.3節(jié)進行計數(shù)，每次計數(shù)做3 個平行實驗。對計數(shù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析，評價質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性。

貯藏條件模擬實驗：模擬實驗周期為4 周。將腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品分別放置于4 ℃和-20 ℃，分別在0、1、3、5、7、14、28 d取出質(zhì)控樣品，每個實驗條件隨機抽取3 個質(zhì)控樣品，按照1.3.1.3節(jié)進行計數(shù)，每次計數(shù)做3 次平行實驗。復蘇率按下式計算。

式中：An為第n天的菌液濃度/（CFU/mL）；A0為 第0天的菌液濃度/（CFU/mL）。

1.3.4 MALDI-TOF-MS穩(wěn)定性檢驗

分別將樣品在37 ℃和-20 ℃環(huán)境下貯藏28 d后進行MALDI-TOF-MS檢驗。將檢測結(jié)果導入BN軟件進行分析整合，分析質(zhì)控樣品MALDI-TOF-MS檢驗穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析對20 瓶腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性檢測結(jié)果進行分析。每次平行實驗的計數(shù)結(jié)果采用平均值±標準差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性檢測結(jié)果

對20 瓶質(zhì)控樣品進行均勻性檢測，由表1可知，樣品計數(shù)結(jié)果平均值為1.90×108CFU。

表1 20 瓶腸炎沙門氏菌標準物質(zhì)計數(shù)結(jié)果Table 1 Counting results of 20 bottles of S. enteritidis reference material108 CFU

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法，對樣品的均勻性進行檢驗。FINV（0.05，19，20）臨界值=2.137，由表2 可知，根據(jù)SPSS軟件計算結(jié)果F=0.75＜FINV（0.05，19，20）臨界值，表明在0.05顯著水平下，質(zhì)控樣品菌株活力無顯著性差異，該樣品符合均勻性要求。

表2 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性實驗結(jié)果Table 2 Results of uniformity test of S. enteritidis quality control sample

2.2 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.2.1 運輸穩(wěn)定性實驗

由表3可知，質(zhì)控樣品貯藏0 d的計數(shù)結(jié)果為1.81×108CFU，在37 ℃環(huán)境下貯藏14 d內(nèi)，腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品活菌數(shù)量雖然有所下降，但均保持在108CFU水平。同樣，在25 ℃環(huán)境下，活菌數(shù)量仍在108CFU水平內(nèi)降低，并且14 d內(nèi)活菌含量較37 ℃更加穩(wěn)定，表明該質(zhì)控樣品可以在運輸中保持菌株數(shù)量，穩(wěn)定性良好。

表3 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品模擬運輸條件實驗結(jié)果Table 3 Stability of S. enteritidis quality control sample under simulated transport conditions 108 CFU

2.2.2 貯藏穩(wěn)定性實驗

由表4可知，質(zhì)控樣品在-20 ℃條件下貯藏28 d后復蘇率為90.6%，4 ℃條件下貯藏28 d后復蘇率為89.0%。2 種貯藏條件下，質(zhì)控樣品復蘇率均在90%左右，證明菌株在貯藏期間活力降低程度很小。綜上所述，模擬貯藏過程中質(zhì)控樣品貯藏穩(wěn)定性良好，可以滿足長期貯藏要求。

表4 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品貯藏穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 Storage stability of S. enteritidis quality control sample

2.2.3 MALDI-TOF-MS穩(wěn)定性實驗

由圖1～2可知，不同存放溫度下，MALDI-TOF-MS檢測腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品結(jié)果穩(wěn)定，譜圖一致，檢測結(jié)果并沒有受到存放環(huán)境溫度的影響。說明質(zhì)控樣品MALDI-TOF-MS檢驗穩(wěn)定性良好，可以作為陽性質(zhì)控樣品在MALDI-TOF-MS檢驗中使用。

圖1 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品在4 ℃條件下的MALDI-TOF-MS譜圖Fig. 1 Mass spectrum of S. enteritidis standard substance stored at 4 ℃

圖2 腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品在－20 ℃條件下的MALDI-TOF-MS譜圖Fig. 2 Mass spectrum of S. enteritidis standard substance stored at ?20 ℃

3 討 論

MALDI-TOF-MS檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用于食源性致病菌檢測的各個方面，如鮑春梅等[30]通過擴充MALDI-TOFMS數(shù)據(jù)庫的方法進行宋內(nèi)志賀菌的鑒定；王耀等[31]應(yīng)用MALDI-TOF-MS采集圖譜，匯總后建立了單增李斯特氏菌的鑒定數(shù)據(jù)庫；李濱州等[32]利用MALDI-TOF-MS鑒別生鮮豬肉中大腸桿菌和沙門氏菌常規(guī)檢驗中出現(xiàn)的類似菌；董青等[33]利用MALDI-TOF-MS技術(shù)分離鑒定出鴨源雞桿菌。但目前尚沒有針對腸炎沙門氏菌的陽性參考樣品和即用型質(zhì)譜鑒定綜合參比體系，并且標準參考樣品尚未實現(xiàn)國產(chǎn)化等問題也成為我國食品中沙門氏菌質(zhì)譜檢測發(fā)展的影響因素。

4 結(jié)論

本研究制備的即用型MALDI-TOF-MS腸炎沙門氏菌質(zhì)控樣品均勻性和穩(wěn)定性可滿足質(zhì)控樣品的要求。樣品F=0.75＜臨界值，表明均勻性良好。樣品在25 ℃和37 ℃環(huán)境下貯藏14 d后活菌數(shù)量穩(wěn)定，說明質(zhì)控樣品在運輸過程中的穩(wěn)定性受溫度影響不大；樣品在-20 ℃和4 ℃環(huán)境下貯藏28 d后活菌數(shù)量穩(wěn)定，根據(jù)以往經(jīng)驗，說明質(zhì)控樣品可以保持長期穩(wěn)定性。樣品在37 ℃和-20 ℃環(huán)境下MALDI-TOF-MS譜圖的一致性保證了樣品可以作為MALDI-TOF-MS質(zhì)控樣品進行鑒定的穩(wěn)定性。因此，本研究研制的即用型質(zhì)控樣品為快速、精準檢測肉類中腸炎沙門氏菌提供了有力的支撐，保證了MALDI-TOF-MS鑒定的準確性。