趙 丹,盧殿杰,于文慧,莊科勤,徐菁岐,董文龍

吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林市 132109

化膿隱秘桿菌原稱化膿棒狀桿菌、化膿放線菌，從隸屬于隱秘桿菌屬，于1997年命名為化膿隱秘桿菌[1]。該菌革蘭氏染色陽性，無鞭毛，無牙孢，無莢膜；在20～40 ℃范圍皆可生長，而37 ℃最適宜[2]；在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成針尖大小的菌落，在血瓊脂培養(yǎng)基上可形成β-溶血環(huán)，需氧厭氧條件下均可生長，且厭氧環(huán)境相比需氧來說該菌長速更快[3]，主要見于牛、羊、豬等易感動物的黏膜和皮膚，是動物黏膜上的共生體，寄生于多種動物的乳腺、泌尿生殖道、呼吸道、胃腸道黏膜[4，5]，并且其存在于動物大部分的局部感染和全身感染中?；撾[秘桿菌可感染患病動物的肺、心內(nèi)膜、子宮等內(nèi)臟組織，引起肺炎、心內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病的化膿性病變[6]。其中一定量的感染是內(nèi)源性的，可引起乳腺炎及孕期牛的流產(chǎn)，給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。同時，據(jù)相關(guān)研究表明，化膿隱秘桿菌不僅對動物具有一定致病性，對人也是如此[7]，且目前尚無防治該細菌感染的有效疫苗，防治主要依靠傳統(tǒng)的抗菌藥。但抗菌藥濫用導致一些病原菌產(chǎn)生了耐藥性，甚至出現(xiàn)多重耐藥性，使抗菌藥治療效果減弱，治療和養(yǎng)殖成本增多[8]。

全基因組測序是微生物研究常用的方法之一，主要通過PacBio RS II等技術(shù)將菌株的全部基因片段進行測序。微生物基因組測序的研究主要圍繞病原微生物和模式微生物進行，通常所說的微生物包括細菌、古細菌、真核微生物和病毒，

它們的基因組通常都比較小，基因組序列與結(jié)構(gòu)功能信息能更快速及時地得到，從而更好地揭示其物種的遺傳學、生物學特性。隨著基因組學、比較基因組學以及篩選差異基因技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，它們的基因組通常都比較小，基因組序列與結(jié)構(gòu)功能信息能及時得到，全基因組核酸測序逐漸成為了值得信賴的鑒定方法[9]。通過全基因組測序，可以對菌株的所有遺傳信息進行分析鑒定，對特殊的基因組進行比較分析，從而得出各種基因型微生物的特性。

近幾年，關(guān)于化膿隱秘桿菌的研究逐漸增多。該菌株特性之一是易造成動物源化膿性感染，但目前關(guān)于受此感染影響下進行的化膿全基因組測序基因比較的報道較少。基于以上情況，本研究從吉林省不同地區(qū)的豬場感染化膿病灶處分離獲得2株化膿隱秘桿菌，從兩株菌株的親緣關(guān)系入手，進行了一系列比較基因組學分析。

1 材料與方法

1.1 化膿隱秘桿菌的來源

本實驗中的菌株分別來自于吉林市某豬場和四平市某豬場的感染化膿隱秘桿菌病死豬患病處分離的兩株菌，在此分別命名為TP13、TP14。

1.2 菌株MIC測定

以化膿隱秘桿菌標準株ATCC19411為質(zhì)控菌株，選用以下多種抗菌藥物（環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星、紅霉素、恩諾沙星、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、頭孢噻呋、四環(huán)素和克林霉素），通過瓊脂擴散法測定菌株TP13和菌株TP14的 MIC 值[10]。

1.3 化膿隱秘桿菌全基因組測序

本試驗的全基因組測序及比較基因組學分析委托北京百邁克生物科技有限公司完成。首先提取高質(zhì)量基因組DNA，采用Nanodrop、Qubit和0.35%的瓊脂糖-凝膠進行純度、濃度和完整性檢驗，并采用BluePippin全自動DNA收集技術(shù)對大片段DNA進行收集，進行文件建庫。然后將原始資料進行統(tǒng)計、質(zhì)量控制，并進行基因組組裝、校正和優(yōu)化，而后分析測序基因組組分、圖譜等內(nèi)容，最終得到基因組相關(guān)信息。

1.4 化膿隱秘桿菌基因組組分分析

使用軟件Prodigal、RepeatMasker、tRNAscan-SE和 Infernal1.1、GenBlastA和 GeneWise、CRT、IslandPath-DIMOB、PhiSpy分別對菌株TP13與菌株TP14的編碼基因、重復序列、非編碼RNA、假基因、CRISPR序列、基因島和前噬菌體進行預(yù)測。

1.5 基因組功能注釋

將菌株TP13和菌株TP14預(yù)測得到的基因 蛋 白 質(zhì) 序 列 與UniPort（Swiss-prot和TrEMBL）、GO（Gene Ontology）、Nr（Non-Redundant Protein Sequence Database）、eggNOG、Pfam、CAZy（Carbohydrate-active enzymes database）、TCDB（Membrane Transport Protein）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、CARD(Comprehensive Antibiotic Research Database)、VFDB（Virulence Factors Database）、PHI-base（Pathogen Host Interactions Database）等功能數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

1.6 比較基因組學分析

在全基因測序的研究基礎(chǔ)上，將菌株TP13和菌株TP14的全基因組測序結(jié)果中的蛋白序列和參考基因組的蛋白序列進行家族分類，統(tǒng)計出測序菌株和參考菌株的特有基因，之后對于基因家族特有基因分析，并將其結(jié)果制成Venn圖。采用軟件MCScanX將測序樣品與每一個參考基因組都成對繪制共線性圖，以獲得各基因組之間的共線性關(guān)系，以便近一步對基因的共線性分析。同時再利用PAML軟件計算Ka/Ks，分析Ka/Ks比值大于1的快速進化基因情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC試驗結(jié)果

分別對菌株TP13和菌株TP14進行抗菌藥物敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)菌株TP13與菌株TP14的耐藥表型一致，均對紅霉素、四環(huán)素、克林霉素、強力霉素表現(xiàn)為耐藥（表1）。

表1 TP13和TP14對抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果

2.2 全基因組測序及分析

根據(jù)全基因組測序結(jié)果比對分析，TP13的總堿基數(shù)有906 647 070個。經(jīng)近一步過濾接頭、低質(zhì)量及短片段的reads后，一共得到了883 856 007個堿基，其基因組長度為2 382 247 bp。組裝矯正后，得到了一個Contig，長度為2 382 247 bp，呈循環(huán)狀。GC含量為59.36%，編碼基因有2 125個，基因序列總長度為2 154 018 bp，重復序列含量占25%，非編碼一共有63個，假基因數(shù)有0個，基因島有4個，前噬菌體數(shù)為3，CRISP序列有4個。

TP14的總堿基數(shù)為712 462 382個。經(jīng)過clean reads后，得到了690 331 224個堿基，基因組的非連續(xù)長度為2 384 675 bp。組裝后得到了一個Contig，長度為2 384 675 bp，屬于染色體，呈循環(huán)狀。GC含量為59.36%，編碼基因有2124個，基因序列總長度為2 154 834 bp，重復含量占24%，非編碼基因一共含有63個，假基因數(shù)有0個，基因島有4個，前噬菌體數(shù)為2，CRISP序列有4個 (表 2)。

表2 TP13與TP14全基因組測序結(jié)果統(tǒng)計

2.3 基因功能注釋

將菌株TP13和TP14的全基因組測序結(jié)果與多種功能數(shù)據(jù)庫進行比對后發(fā)現(xiàn)：菌株TP13和菌株TP14均有85個碳水化合物酶類基因，573種轉(zhuǎn)運蛋白，3個抗生素抗性基因（tet(33)、ErmX、tetW）。將菌株TP13與菌株TP14進行相互對比后發(fā)現(xiàn)，其不同之處主要在于病原與宿主互作因子與致病因子的數(shù)量，菌株TP13具有674個病原與宿主互作因子，334個致病因子，而菌株TP14有675個病原與宿主互作因子，333個致病因子（表3）。

表3 TP13與TP14基因功能注釋結(jié)果

2.4 比較基因組學分析

2.4.1 Venn圖分析：通過OrthoMCL軟件制作TP13與TP14的韋恩圖，對于參與家族聚類的基因來說，菌株TP13基因家族有2 120個，菌株TP14基因家族有2 119個，其中有2 094個基因家族是重疊的，其基因家族共有率高達約99.95%。而菌株TP13具有1個特有家族，表明菌株TP13與菌株TP14可能是由同一化膿隱秘桿菌進化而來，是2株親緣較為接近的化膿隱秘桿菌。

2.4.2 基因的共線性：將菌株TP13與菌株TP14的蛋白序列分別與每一個參考基因組的蛋白序列進行BLAST比對，然后根據(jù)同源基因在基因組序列上的位置信息，得到核酸水平上的共線性關(guān)系。用軟件MCScanX對測序樣品與各參考基因組都成對繪制共線性圖。發(fā)現(xiàn)菌株TP13和菌株TP14存在大量同源性基因，共線性關(guān)系顯著。由此說明菌株TP13與菌株TP14確實具有共線性。

2.4.3 快速進化基因檢測：Ka是指非同義替換點替換次數(shù)，Ks是指同義替換位點替換次數(shù)，Ka/Ks表示非同位替換點替換次數(shù)與同義替換位點替換次數(shù)之間的比值。此比值能夠判定在此蛋白編碼基因上是否存在選擇性的壓力。而具體分析比值內(nèi)容可參考核苷酸變異，沒有引起氨基酸變化的核苷酸變異被稱為同義性突變，反之則為非同義突變，同義突變不受自然選擇，而非同義突變受自然選擇作用。當Ka/Ks＞1時，被認為有正選擇效應(yīng)(positive selection)；若Ka/Ks=1，則認為存在中性選擇(neutral evolution)；而Ka/Ks＜1,則認為有純化選擇作用。下列表格中是菌株TP13與TP14的Ka/Ks值，大部分的Ka/Ks均小于1，說明菌株TP13與TP14大部分都受純化選擇作用，存在極少部分Ka/Ks值大于1，說明還是有少數(shù)基因受環(huán)境因素有正選擇效應(yīng)（表4）。

表4 TP13和TP14 Ka/Ks值

3 討論

化膿隱秘桿菌是一種對反芻家畜和豬都有很大影響的共生條件性病原，也能使野生動物[11]發(fā)生感染，例如化膿隱秘桿菌能導致白尾鹿的顱內(nèi)化膿性腦膜炎，而白尾鹿又是化膿隱秘桿菌的保藏宿主，對家畜有潛在的危害。在運輸、寒冷、斷奶及其他異常條件刺激時，動物的免疫力會降低，而體內(nèi)的化膿隱秘桿菌或已經(jīng)處于隱性感染情況下的化膿隱秘桿菌大量增殖，則會增加疾病的發(fā)生或惡化?；撾[秘桿菌通常也是動物體內(nèi)的正常菌群組成之一，常寄生于上呼吸道和消化道黏膜，主要引起豬、牛、羊等經(jīng)濟型動物多器官和黏膜發(fā)生化膿性感染，嚴重感染可引起多重器官衰竭，最后形成膿毒敗血癥而導致動物死亡[12]。化膿隱秘桿菌的毒性取決于多種毒力因子，不同的毒力因子之間存在著協(xié)同效應(yīng)，并且細菌可以在不同宿主中差異表達各種毒力基因而引發(fā)不同的感染癥狀。目前已發(fā)現(xiàn)的化膿隱秘桿菌毒力因子有化膿隱秘桿菌溶血素[13]、膠原結(jié)合蛋白(CbpA)[14]、神經(jīng)氨酸酶(Nan)[15]及菌毛合成蛋白(Fim)[16]等。這些毒力因子對化膿隱秘桿菌在不同宿主體內(nèi)的棲居狀態(tài)和引發(fā)各種感染過程均發(fā)揮了重要作用。

近年來，由于抗生素的不合理使用甚至濫用，導致越來越多的耐藥菌株出現(xiàn)，并在區(qū)域內(nèi)造成大規(guī)模耐藥菌株的流行現(xiàn)象，多地的化膿隱秘桿菌均對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類藥物出現(xiàn)了不同程度的耐藥現(xiàn)象。在治療過程中，由于藥物到達病灶部位的藥量有限，因此在化膿隱秘桿菌治療中，抗生素常常不起作用，并且化膿隱秘桿菌可持續(xù)存在于易感動物體內(nèi)，患病常呈散發(fā)，無明顯的季節(jié)性，但由其引發(fā)的奶牛乳房炎有明顯的季節(jié)性?；撾[秘桿菌的耐藥機制有很多種，其中一種是由耐藥基因介導而引起的耐藥特性，本研究所分離菌株TP13與菌株TP14均攜帶tet(33)、ErmX、tetW 3種耐藥基因，這與趙敬翠等人研究結(jié)果相似，菌株對四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥特性多由四環(huán)素耐藥基因所介導[17]。趙克雷等研究發(fā)現(xiàn)了化膿隱秘桿菌耐藥性的產(chǎn)生是受其耐藥基因的表達、突變、轉(zhuǎn)移和傳遞所致，同時也通過質(zhì)粒、整合子-基因盒系統(tǒng)等可移動元件從外界得到了耐藥基因，發(fā)現(xiàn)了滅活酶的產(chǎn)生、生物被膜的形成、主動排外機制均能使化膿隱秘桿菌產(chǎn)生耐藥性。而本研究在參考以上觀點的基礎(chǔ)上，重點對吉林省不同地區(qū)耐藥表型相似的豬源化膿隱秘桿菌進行全基因組測序與比較基因組學分析的研究，證實了菌株TP13與菌株TP14是源于不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)但親緣關(guān)系相近的化膿隱秘桿菌。由此進一步推測化膿隱秘桿菌菌株的親緣性產(chǎn)生的原因，大概率是受現(xiàn)實條件下對家畜動物運輸買賣影響，由動物的異地流動，導致了其攜帶病菌的轉(zhuǎn)移流行，最終使菌株在不同生存環(huán)境下進一步進化變異，產(chǎn)生了發(fā)源地不同但親緣性相近的流行菌株。這一研究發(fā)現(xiàn)，或可表明親緣性對探討各類菌株流行與變化所發(fā)揮的重要作用。而借助親緣性這一角度，深入了解不同菌株存在的相似的流行與進化特性，便能幫助我們從病菌本源入手，觀察菌株本體特質(zhì)，追蹤病菌流行軌跡，總結(jié)動物染病發(fā)病規(guī)律，從而為更好應(yīng)對不同地區(qū)的各類動物疾病提供更多可行性的解決方法。