李曹杰 李嘉浚 陳榮新

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科 上海 200032； 2復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所 上海 200032）

據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)，肝細(xì)胞癌（以下簡稱：肝癌）是全球第六大最常見癌癥和第四大癌癥死亡原因［1］。肝癌的主要病因是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、非酒精性脂肪性肝病、黃曲霉毒素暴露、飲酒、肥胖和某些遺傳性疾病等［2］。肝癌發(fā)生發(fā)展與這些致病因素導(dǎo)致的肝臟慢性炎癥、過度纖維化、肝硬化，肝臟微環(huán)境嚴(yán)重紊亂，特別是免疫微環(huán)境失調(diào)存在密切關(guān)系。與其他實(shí)體腫瘤不同，80%～90%的肝癌起源于肝炎、肝纖維化和肝硬化演進(jìn)過程［3］。

微環(huán)境對于腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要性已得到大家公認(rèn)；其對腫瘤的影響包括維持增殖信號、逃避生長抑制因子、抵抗細(xì)胞死亡、使復(fù)制永生、誘導(dǎo)血管生成、激活侵襲轉(zhuǎn)移、能量代謝重編程以及逃避免疫［4］。由于肝癌微環(huán)境復(fù)雜，Affo 等［5］提出將肝癌微環(huán)境分為癌前微環(huán)境和腫瘤微環(huán)境：先于肝癌發(fā)生，以肝細(xì)胞死亡、慢性炎癥和纖維化為特征是癌前微環(huán)境；肝癌發(fā)生后，與腫瘤共同發(fā)展演進(jìn)的微環(huán)境稱為腫瘤微環(huán)境。微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞，包括髓系來源細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，通過細(xì)胞之間直接接觸、可溶性因子旁分泌或者細(xì)胞外基質(zhì)等相互作用，促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展［6］。本文就肝纖維化因素如何影響免疫微環(huán)境，及其促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的途徑和機(jī)制，作一綜述。

肝纖維化因素肝臟微環(huán)境由多種間質(zhì)細(xì)胞成分，包括肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞，和非細(xì)胞成分（如生長因子、蛋白水解酶及其抑制劑）以及其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組成［7］。肝纖維化過程包括HSC 激活，以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致肝臟組織生理生化、物理結(jié)構(gòu)和功能異常。肝損傷發(fā)生時(shí)，HSC從靜止?fàn)顟B(tài)維生素A 儲存細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為α-SMA 陽性、產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞［8］。研究表明［9］，活化的HSC 是肝纖維化的主要貢獻(xiàn)者，而與具體致病因素?zé)o關(guān)。HSC 也是癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancerassociated fibroblasts，CAF）的主要來源，在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。利用單細(xì)胞測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Tcf21 特異性表達(dá)于HSC，Tcf21+ HSC 是肝纖維過程中肌成纖維細(xì)胞和肝癌CAF 主要細(xì)胞來源［10］。激活的HSC、肌成纖維細(xì)胞、CAF 通過多種途徑及機(jī)制影響免疫微環(huán)境，使免疫細(xì)胞發(fā)生功能障礙，形成免疫抑制性微環(huán)境，促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展［11］。文獻(xiàn)提示HSC 可能在抗原呈遞和T 淋巴細(xì)胞啟動(dòng)中起直接作用，但這仍需要深入研究［12-13］。

除了HSC 異常激活以外，肝纖維化主要表現(xiàn)形式為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白大量沉積、排列、交聯(lián)，產(chǎn)生生物化學(xué)和物理改變。細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖、蛋白聚糖構(gòu)成復(fù)雜的支持網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，結(jié)合很多生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、透明質(zhì)酸等具有調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞的功能。除了這些生化因素，基質(zhì)蛋白沉積、交聯(lián)產(chǎn)生的基質(zhì)硬度/彈性，這一生物物理因素也對肝癌發(fā)生發(fā)展起重要作用［14］。

肝纖維化對免疫微環(huán)境影響腫瘤發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)存在密切關(guān)系。固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，是機(jī)體的第一道防線。先天免疫細(xì)胞、適應(yīng)性免疫T 細(xì)胞和B 細(xì)胞一起構(gòu)成免疫監(jiān)視，會限制腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）、CD4+T 細(xì)胞（Th1）、NK 細(xì)胞和DC 等功能障礙，參與了免疫抑制微環(huán)境形成［15］。固有免疫和適應(yīng)性免疫共同構(gòu)成免疫監(jiān)視，肝癌發(fā)生發(fā)展與免疫細(xì)胞的腫瘤監(jiān)視功能失敗有關(guān)［6］。

固有免疫

骨髓源性抑制細(xì)胞根據(jù)表型、形態(tài)學(xué)特征將骨髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）分為兩個(gè)主要亞群：多形核細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN）和單核細(xì)胞（monocytic，M）的MDSC，即PMN-MDSC 和M-MDSC，分別與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞具有相同的表型和形態(tài)特征［16］。MDSC 是從肥胖到癌癥各種病理狀況下產(chǎn)生的異質(zhì)性細(xì)胞群，其顯著特征是具有抑制T 細(xì)胞的功能［17］。某些情況下，M-MDSC 有比PMNMDSC 更高的免疫抑制活性［18］。值得注意的是，肝纖維化微環(huán)境中HSC 在單核細(xì)胞分化為MDSC 中起作用。在一種原位肝癌小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)中，HSC 增加了肝癌中MDSC 數(shù)量［19］。將外周血單核細(xì)胞與活化HSC 共培養(yǎng)研究，結(jié)果出現(xiàn)了與MDSC 具有相似表型和功能特征的CD14+HLADR-/low細(xì)胞，表明活化的HSC 可以將成熟的外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MDSC，而且這個(gè)過程可被CD44抗體阻斷［20］。另有研究報(bào)道［21］，HSC 通過過氧化氫酶介導(dǎo)的過氧化氫耗竭，誘導(dǎo)了CD14+HLA-DRlow/-抑制性細(xì)胞產(chǎn)生。此外，活化的HSC 通過COX2-PGE2-EP4 信號途徑誘導(dǎo)MDSC 聚集，促進(jìn)肝癌生長［22］。通過肝纖維化動(dòng)物模型和臨床標(biāo)本驗(yàn)證，纖維化肝臟中M-MDSC 積聚與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）減少、肝癌發(fā)生顯著相關(guān)；機(jī)制上，HSC 通過p38 MAPK 介導(dǎo)的增強(qiáng)子重編程誘導(dǎo)M-MDSC 聚集和免疫抑制［23］。肝癌中MDSC 不僅通過抑制NK 細(xì)胞抑制固有免疫應(yīng)答［24］，而且可以抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答，能夠誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）［25］，抑制CD8+T 細(xì)胞免疫效應(yīng)［26］，發(fā)揮免疫抑制作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞通過CCRK 激活EZH2/NF-κB/IL-6 信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致PMNMDSC 在肝癌中異常集聚，從而抑制INF-γ+TNFα+CD8+T 細(xì)胞免疫浸潤，促進(jìn)腫瘤發(fā)生［27］。去除內(nèi)源性免疫抑制細(xì)胞如MDSC、Treg 和PD-1（+） T 細(xì)胞，能夠恢復(fù)晚期肝癌患者CD8+T 細(xì)胞功能［28］。以上這些研究提示肝纖維化微環(huán)境有利于MDSC產(chǎn)生，MDSC 免疫抑制功能促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）起源于外周血循環(huán)單核細(xì)胞前體，通過腫瘤來源信號，如MCP-1 和M-CSF 募集到腫瘤微環(huán)境中［29-30］。一般來說，單核/巨噬細(xì)胞可以極化為M1 或M2 型巨噬細(xì)胞。TAM 被認(rèn)為更類似于M2 極化的巨噬細(xì)胞。微環(huán)境中，TAM 通過前列腺素E2（PGE2）、白介素-10（IL-10）和吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）誘導(dǎo)Treg 產(chǎn)生，通過CCL17、CCL18 和CCL22 趨化因子招募Treg；Treg 產(chǎn)生的IL-10 可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)PD-L1，以上途徑均導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中T 細(xì)胞受到抑制［31］。臨床研究和小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@示，TAM 具有免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，也是潛在治療的靶標(biāo)［32-33］。TAM 在促進(jìn)肝纖維化方面發(fā)揮重要作用［34-37］。HSC 對于TAM 也有影響，當(dāng)單核細(xì)胞與HSC 共同培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞表面CD14、CCR2 和CD15 表達(dá)增加，CD86 表達(dá)下調(diào)，將細(xì)胞因子表達(dá)從促炎信號轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种菩盘枺瓷险{(diào)免疫抑制細(xì)胞因子和下調(diào)炎癥性細(xì)胞因子［38］。肝癌細(xì)胞與TAM 存在互動(dòng)，肝癌細(xì)胞分泌Wnt 配體通過Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)TAM 向M2 型極化，從而促進(jìn)肝癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫抑制［39］。CCL2/CCR2 信號軸介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞在肝癌中浸潤。CCR2 拮抗劑阻斷肝癌浸潤巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)，增加CD8+T 細(xì)胞數(shù)量，抑制肝癌生長［40］。這些研究提示，肝纖維化微環(huán)境中HSC 促進(jìn)TAM形成，TAM 通過抑制免疫促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。

NK 細(xì)胞NK 細(xì)胞是第一個(gè)天然淋巴樣細(xì)胞家族的成員，具有特殊細(xì)胞溶解功能的主要群體細(xì)胞［41］。Li 等［42］發(fā)現(xiàn)肝癌來源的CAF 誘導(dǎo)NK 細(xì)胞功能障礙，使其低表達(dá)細(xì)胞毒分子，減少細(xì)胞因子產(chǎn)生，體外對K562 靶細(xì)胞殺傷活性下降?；罨衫w維細(xì)胞通過PGE2 和IDO 抑制NK 細(xì)胞激活，促進(jìn)肝癌進(jìn)展。Tan 等［43］發(fā)現(xiàn)磷酸化Tim-3 通過干擾PI3K/mTORC1 信號通路激活，抑制NK 細(xì)胞功能并抑制其細(xì)胞因子分泌，從而促進(jìn)肝癌生長。另一方面，NK 細(xì)胞與肝纖維化存在關(guān)系。小鼠模型中，NK 細(xì)胞可以通過殺傷HSCs 和產(chǎn)生IFN-γ 緩解肝纖維化。Shi 等［44］發(fā)現(xiàn)在肝硬化情況下，激活的HSC 通過TGF-β 依賴性方式損害NK 細(xì)胞的抗纖維化能力。

DC 細(xì)胞DC 細(xì)胞是專職的抗原呈遞細(xì)胞，在激活幼稚T 細(xì)胞和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有重要作用。在大多數(shù)腫瘤中存在一部分調(diào)節(jié)性DC，誘導(dǎo)Treg 分化，具有較低的促進(jìn)T 細(xì)胞增殖能力和較高促進(jìn)免疫耐受的能力，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫防御［45］。研究表明，微環(huán)境對于DC 功能有重要影響，Cheng 等［46］報(bào)道了肝癌來源的CAF 通過IL-6 介導(dǎo)STAT3 激活，招募DC 并且促使其轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生IDO 調(diào)節(jié)性DC，表現(xiàn)出免疫耐受性表型，具有顯著抑制T 細(xì)胞增殖和上調(diào)Treg 產(chǎn)生的能力。另一方面，肝纖維化小鼠模型中，DC 通過產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9），促進(jìn)肝纖維化消退［47］。

中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞是腫瘤內(nèi)浸潤最多的免疫細(xì)胞之一，對于腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用［48］。中性粒細(xì)胞可以通過抑制抗腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。Cheng 等［49］發(fā)現(xiàn)肝癌來源的CAF通過IL6-STAT3-PD-L1 信號調(diào)控肝癌相關(guān)的中性粒細(xì)胞的存活、激活及抑制免疫的功能。有趣的是，Harty 等［50］和Saijou 等［51］報(bào)道肝纖維化小鼠動(dòng)物模型中，中性粒細(xì)胞通過MMP 減輕肝纖維化，促進(jìn)肝臟修復(fù)。

適應(yīng)性免疫

T 細(xì)胞T 細(xì)胞主要在胸腺發(fā)育，產(chǎn)生CD4+或CD8+單陽性胸腺細(xì)胞，最終以CD45RA+CCR7+表型的幼稚T 細(xì)胞形式出現(xiàn)在外周。CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞，占CD4+單陽性胸腺細(xì)胞的9%～10%［52］。腫瘤微環(huán)境中，識別出導(dǎo)致T 細(xì)胞功能障礙的潛在驅(qū)動(dòng)分子，對于腫瘤免疫治療具有重要意義［53］。炎癥相關(guān)肝癌小鼠模型中，CD8+T 細(xì)胞和淋巴毒素-β 有促瘤功能［54］。纖維化微環(huán)境中，HSC 通過多種途徑和機(jī)制影響T 細(xì)胞功能。Yu 等［55］發(fā)現(xiàn)HSC 誘導(dǎo)的T 細(xì)胞低反應(yīng)性與B7-H1/PD-1 介導(dǎo)T細(xì)胞凋亡有關(guān)。隨后一系列研究表明，活化的HSC通過誘導(dǎo)T 細(xì)胞低反應(yīng)性，并加速激活效應(yīng)T 細(xì)胞凋亡，增加Treg 細(xì)胞數(shù)量，抑制T 細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用，發(fā)揮其免疫抑制作用［56-61］。

B 細(xì)胞B 細(xì)胞是機(jī)體體液免疫的主要細(xì)胞。目前，B 細(xì)胞在肝癌發(fā)展中的作用尚存爭議。B 細(xì)胞與局部免疫激活及肝癌患者的預(yù)后有關(guān)；肝癌小鼠模型中，通過抗CD20 抗體去除B 細(xì)胞，降低局部T 細(xì)胞激活，促進(jìn)肝癌生長［62］。另一項(xiàng)Mdr2-/-炎癥相關(guān)肝癌小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，抗CD20 抗體去除B 細(xì)胞，促進(jìn)HSC 細(xì)胞衰老介導(dǎo)的肝纖維化消退，抑制TNF-α/NF-κB 促癌通路，減少肝癌發(fā)生；人肝癌標(biāo)本中，B 細(xì)胞浸潤與肝癌侵襲性增加、無瘤生存率降低相關(guān)［63］。

腫瘤微環(huán)境的其他因素

轉(zhuǎn)化生長因子轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）由微環(huán)境中多種細(xì)胞產(chǎn)生，例如肌成纖維細(xì)胞、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并儲存在細(xì)胞外基質(zhì)中［64-65］。肝癌發(fā)生發(fā)展中TGF-β 起著雙重作用。早期肝癌發(fā)生過程中，TGF-β 發(fā)揮抑制腫瘤作用；一旦細(xì)胞對其抑制作用產(chǎn)生抵抗后，TGF-β 作用就轉(zhuǎn)為促癌作用，促進(jìn)細(xì)胞存活，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲［65］。肝纖維化微環(huán)境中HSC 或CAF 可通過產(chǎn)生TGF-β，促進(jìn)免疫抑制性微環(huán)境形成。TGF-β 通過調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞，涉及NK 細(xì)胞、DC 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、CD8+、CD4+T 細(xì)胞以及Treg 細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［66-67］。在TGF-β 水平較高的情況下，TAM 主要極化為M2 表型［68］；CAF 以TGF-β 依賴方式上調(diào)Treg產(chǎn)生［69］；TGF-β 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄因子參與了幼稚T 細(xì)胞向具有強(qiáng)大免疫抑制功能的CD4+CD25+Treg 細(xì)胞轉(zhuǎn)變［70］。抑制TGF-β 可顯著增強(qiáng)腫瘤對PD-1/PD-L1 檢查點(diǎn)抑制劑治療敏感性，增強(qiáng)抗腫瘤療效［71-72］。

肝纖維化微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）主要由激活的HSC 產(chǎn)生［8］。肝癌微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞釋放TGF-β1 誘導(dǎo)HSC 產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)成分，如纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原等。異常ECM 提供了一個(gè)物理屏障，阻止免疫細(xì)胞浸潤［73］。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明［74］，在玻璃上培養(yǎng)的單核細(xì)胞分化為類似于活化巨噬細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。纖維化環(huán)境下，ECM 蛋白成分和含量明顯改變，通過細(xì)胞表面受體（包括整聯(lián)蛋白、CD44、RHAMM、GPVI、LAIR-1［75］、OSCAR 或GPR56）直接或間接影響浸潤的免疫細(xì)胞功能，從而改變免疫反應(yīng)［76］。

代謝酶必需營養(yǎng)素的耗盡以及免疫抑制代謝物積累會產(chǎn)生適合腫瘤發(fā)展的微環(huán)境［77］。微環(huán)境中免疫抑制代謝物主要是經(jīng)IDO 和色氨酸2，3-雙加氧酶（TDO）、精氨酸酶降解色氨酸、精氨酸而產(chǎn)生，能抑制多種免疫細(xì)胞活性，包括：CTL、Th1細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、MDSC 等［78］。IDO 活性升高，促進(jìn)機(jī)體對腫瘤相關(guān)抗原的病理性免疫耐受，是腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)防御的一種機(jī)制［79］。研究表明，IDO 與PGE2 共同介導(dǎo)了肝癌來源CAF 對 NK 細(xì)胞活性的抑制作用［42］。

基質(zhì)硬度基質(zhì)硬度促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展，但是否通過調(diào)控免疫微環(huán)境促進(jìn)肝癌進(jìn)展并不清楚?；|(zhì)硬度還促進(jìn)HSC 激活、巨噬細(xì)胞M2 極化、T細(xì)胞增殖、遷移、DC 細(xì)胞表型調(diào)控［80-83］及肺癌細(xì)胞PD-L1 表達(dá)［84］?；|(zhì)硬度促進(jìn)CAF 形成和激活，胰腺癌中CAF 分泌βig-h3 調(diào)控免疫微環(huán)境，促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展［85］。

結(jié)語目前，肝癌靶向治療藥物（如sorafenib、regorafenib、lenvatinib、cabozantinib［86-89］）對患者生存率的改善有限，免疫治療出現(xiàn)為肝癌治療提供了全新的局面［90］。肝纖維化與免疫細(xì)胞存在密切互動(dòng)關(guān)系，肝纖維化促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境形成，促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。從中尋找新的免疫治療靶點(diǎn)與途徑，對進(jìn)一步提高免疫治療效果具有重要意義。

作者貢獻(xiàn)聲明李曹杰 論文構(gòu)思、撰寫和修訂，文獻(xiàn)檢索。李嘉浚 論文整理、撰寫和修訂，文獻(xiàn)檢索。陳榮新 論文構(gòu)思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。