陶威，張?zhí)K珍，田蘊(yùn)*，王益軍，龔其龍，彭程

（1.連云港市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 連云港 222000；2.連云港市連云區(qū)漁業(yè)技術(shù)推廣站，江蘇 連云港 222042；3.句容市水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 鎮(zhèn)江 212400）

喹諾酮（QNs）類藥物因抗菌譜廣、價(jià)格低廉、使用方便以及抗菌機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中廣泛使用。然而，QNs 在食品性水產(chǎn)中的殘留，可直接對(duì)人類造成危害，此外長期大量使用這類藥物造成的低濃度的殘留藥物，可能會(huì)對(duì)敏感致病菌產(chǎn)生耐藥性，且部分QNs 還有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[1-3]，從而間接威脅到人類的健康。因此，對(duì)水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。

本研究以青魚（Mylopharyngodon piceus）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）和南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）為試驗(yàn)對(duì)象，建立了青魚、泥鰍、南美白對(duì)蝦肌肉組織中7 種QNs 藥物[恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、諾氟沙星（NOR）、洛美沙星（LOM）、沙拉沙星（SAR）、和培氟沙星（PEF）]殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），以期為開展水產(chǎn)食品中QNs 類藥物殘留測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品、主要試劑與材料

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品：99.78%，德國Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)93106-60-6；環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品：92.31%，德國Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)93107-08-5；氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品：95.71%，德國Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)82419-36-1；諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品：97.26%德國Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)70458-96-7；洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品：97.26%，德國Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)98079-52-8；沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品：85.82%，德國Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)91296-87-6；培氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品：92.19%，德國Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)70458-95-6。

恩諾沙星-D5 鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品：99.8%，德國WITEGA；環(huán)丙沙星-D8 標(biāo)準(zhǔn)品：94.3%，德國WITE GA，批號(hào)1216659-54-9；氧氟沙星-D3 標(biāo)準(zhǔn)品：99.1%，德國WITEGA，批號(hào)1173147-91-5；諾氟沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)品：80.4%，德國WITEGA，批號(hào)1015856-57-1；洛美沙星-D5 鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品：99.3%，德國WITEGA；沙拉沙星-D8 鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品：91.1%，德國WITEGA；培氟沙星-D5 標(biāo)準(zhǔn)品：99.4%，德國WITEGA，批號(hào)1228182-51-1。

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，美國Merck 有限公司；超純水：實(shí)驗(yàn)室自制（美國Millipore 公司），符合《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/T 6682—2008）；有機(jī)濾膜（0.22 μm）：上海安普科技有限公司；Oasis PRIME HLB 固相萃取柱：美國Waters 公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

超高效液相WatersTQ-S（配有自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，美國Waters 公司）；三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源，美國Waters 公司）；軟件MassLynx 4.2（美國Waters 公司）；電子分析天平：CPA 225D 型（德國Sartorius 公司）；固相萃取儀Supelco 24 位（美國Supelco 公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：3-30 KS 型（德國sigma 公司）；超聲波清洗器：SK 8200 H 型（上?？茖?dǎo)公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Hei-VAPPrecision 型（德國Heidolph 公司）；氮吹儀：N-EVAP 24 位型（美國Organomation 公司）；超純水儀：Milli-QAdvantageA 10 型（美國Millipore公司）；基本型圓周混合器：0～3 000 r/min（德國IKA 公司）。

1.3 樣品采集

從江蘇省東辛農(nóng)場(chǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司選擇個(gè)頭均勻、鱗片完好且較為光澤、健康活躍的青魚4 尾，平均體質(zhì)量為（350±20）g，平均體長為（23±2）cm；選擇個(gè)頭均勻、健康活躍的南美白對(duì)蝦2 kg，平均體長為（10±2）cm，平均體質(zhì)量為（12±2）g；從贛榆區(qū)墩尚鎮(zhèn)某泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)，選擇體表完好、健康活躍的泥鰍20 尾，平均體長為（15±1）cm，平均體質(zhì)量為（70±10）g。將試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行解剖，采集可食用組織樣品進(jìn)行編號(hào)，放入準(zhǔn)備好的塑封袋中，于-18 ℃冷凍備用[4]。

1.4 分析條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC○R BEH C18 色譜柱，1.7 μm，（2.1×50）mm；保護(hù)柱：VanGuard TM Pre-Column3/PK，（2.1×5）mm；流動(dòng)相A：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；流動(dòng)相B：純甲醇；流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；柱溫40 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化方式下正離子電離（ESI+）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴霧電壓：800 kV；錐孔電壓：10 V；汽化溫度：550 ℃；去溶劑氣流量：1 000 L/h；錐孔反吹氣：150 L/h；碰撞能量：4 eV。

第一個(gè)四級(jí)桿，低質(zhì)量數(shù)端：2.8 u，高質(zhì)量數(shù)端：14.72 u；離子能量：0.1 eV。第二個(gè)四級(jí)桿，低質(zhì)量數(shù)端：2.8 u，高質(zhì)量數(shù)端：14.78 u，離子能量：0.5 eV。

1.5 樣品前處理

肌肉樣品于室溫下解凍，稱?。?.0±0.02）g，于50 mL 聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入20 μL 質(zhì)量濃度為1 mg/L 的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入10 mL 1%酸化乙腈溶液，渦旋震蕩萃取10 min，超聲波萃取5 min，10 000 r/min 離心10 min，無須活化和平衡，取6 mL 上清液直接注入6 mL Prime HLB（6 cm3200 mg）固相萃取柱，保持1 滴/s 的流量，收集全部流出液。取5 mL 流出液，在40 ℃下氮吹至＜0.5 mL。殘?jiān)后w用流動(dòng)相溶液定容至1 mL，經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾，供UPLC-MS/MS 測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)比分析了在流動(dòng)相中分別加入乙酸銨和甲酸目標(biāo)響應(yīng)和峰形圖。結(jié)果表明，0.1%甲酸水和乙酸銨目標(biāo)響應(yīng)值相差不大，但是在0.1%甲酸水條件下，化合物的峰型更對(duì)稱，因此選擇0.1%甲酸水溶液作為水相。分析了0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸-甲醇為流動(dòng)相時(shí)7 種QNs 藥物的分離效果，結(jié)果表明，當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí)，出峰時(shí)間較快，但恩諾沙星、諾氟沙星和恩諾沙星-D5 的出現(xiàn)雙頭峰，物質(zhì)分離效果不佳，組分重合，分離度達(dá)不到要求，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)、線性不佳。當(dāng)有機(jī)相為甲醇時(shí)，出峰時(shí)間較乙腈偏后，但各物質(zhì)的峰型對(duì)稱，分離效果較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好。因此本試驗(yàn)采用0.1%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相。7 種QNs 藥物正離子掃描特征離子色譜圖見圖1[5-6]。

圖1 7 種QNs 藥物及其同位素內(nèi)標(biāo)的正離子掃描特征離子圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)選用甲醇-0.1%甲酸水溶液（體積比為1∶1），配制成100 μg/L 7 種QNs 藥物的標(biāo)準(zhǔn)品工作液和7 種QNs 同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為質(zhì)譜調(diào)諧液，通過針泵直接進(jìn)樣分析，正離子掃描模式，針泵流量10 μL/min。試驗(yàn)使用的是三重四級(jí)桿分辨質(zhì)譜，選擇質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring,MRM）模式進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集[7-8]。得出多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件，離子對(duì)、錐孔電壓，碰撞能量見表2。

表2 7 種QNs 藥物的分子質(zhì)量和質(zhì)譜參數(shù)①

續(xù)表

2.3 方法線性和檢出限

準(zhǔn)確量取7 種QNs 藥物混合溶液，用10%甲 醇水溶液稀釋成濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 和100.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，含內(nèi)標(biāo)物濃度為10.0 μg/L，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定[9]。內(nèi)標(biāo)法以各特征離子質(zhì)量色譜峰與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。由表3 可見，7 種QNs 藥物濃度0.5～100.0 μg/L 呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998 446～0.999 799。

根據(jù)特征離子色譜峰信噪比[（S/N）=3]，計(jì)算得出7 種QNs 藥物檢出限為0.01～0.34 μg/kg。按照S/N=10，得出7 種QNs 藥物定量限為0.04～0.87 μg/kg。見表3。

2.4 回收率

稱取青魚、泥鰍和南美白對(duì)蝦空白樣品，7 種QNs 藥物在5.0，10.0 和20.0 μg/kg 添加水平下，按照1.5 方法進(jìn)行前處理，每個(gè)水平重復(fù)3 次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表4。由表4可見，7 種QNs 藥物回收率在青魚中為92.71%～105.31%，泥鰍中為92.31%～109.38%，南美白對(duì)蝦中為92.31%～106.76%。結(jié)果表明，該方法具有較好的回收率，可以滿足青魚、泥鰍、南美白對(duì)蝦中7 種QNs 藥物殘留的日常檢測(cè)要求。

表4 青魚、泥鰍、南美白對(duì)蝦中7 種QNs 的平均回收率和RSD

續(xù)表

2.5 精密度

按照1.5 前處理方法，分別稱取青魚、泥鰍、南美白對(duì)蝦樣品，進(jìn)行陽性添加，在5.0，10.0 和20.0 μg/kg 添加水平下，重復(fù)6 次，進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算RSD。同樣操作方法，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度RSD，結(jié)果見表5。由表5 可見，青魚中7 種QNs 日內(nèi)精密度RSD 為0.68～6.54，日間精密度RSD 為1.16～8.49；泥鰍中7 種QNs 日內(nèi)精密度RSD 為1.84～6.94，日間精密度RSD 為2.48～8.27；南美白對(duì)蝦7 中QNs 日內(nèi)精密度RSD 為0.29～8.29，日間精密度RSD 為1.45～8.14。該方法具有較好的重復(fù)性和精密度，可以滿足青魚、泥鰍、南美白對(duì)蝦中7 種QNs 藥物殘留的日常檢測(cè)要求。

表5 青魚、泥鰍、南美白對(duì)蝦中7 種QNs 的平均回收率和RSD

續(xù)表

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了水產(chǎn)品中7 種喹諾酮類獸藥殘留的檢測(cè)方法——超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。該方法與普通液相色譜法相比，定性定量更準(zhǔn)確，檢測(cè)速度提升，分離時(shí)間短，方法的靈敏度和重現(xiàn)性較好，穩(wěn)定性高，能較好地滿足水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留分析的檢測(cè)要求，同時(shí)溶劑用量大為減少，降低了分析成本，使檢測(cè)效率得到提升，可以用來檢測(cè)水產(chǎn)品中7 種喹諾酮藥物的殘留量。