米 多,陳 雨,邢 蕓,陳銀華,陶 均,李春霞
(海南大學(xué) 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/熱帶作物學(xué)院,???570228)
DNA 是大多數(shù)生物的遺傳信息載體,是保證物種延續(xù)性的基礎(chǔ),微小的變化都可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致命的影響[1]。在生命進(jìn)化的過程中,DNA 一直受到外界環(huán)境和內(nèi)部因素的影響。細(xì)胞中dNTPs 和rNTPs 濃度改變、DNA 聚合酶保真性變化和外界環(huán)境改變都可能導(dǎo)致高突變率和非完全同源DNA 序列之間的重組能力增加,進(jìn)而影響基因組的穩(wěn)定性[2]。DNA 錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)系統(tǒng)可以糾正復(fù)制和重組過程中發(fā)生的DNA 堿基錯(cuò)配,確保染色體復(fù)制的精確性和維持基因組的穩(wěn)定性[3]。
MutL/MutS 是原核生物最重要的MMR 系統(tǒng)。DNA 錯(cuò) 配 修 復(fù) 蛋 白 MutL 羧 基 端 含MLH1 和PMS2 二聚體結(jié)構(gòu)域,其中PMS2 具有內(nèi)切酶活性;MutL 氨基端具有ATP 酶和DNA 結(jié)合活性[4-6]。當(dāng)MMR 復(fù)合體中的另一個(gè)關(guān)鍵蛋白MutS 識(shí)別并結(jié)合到發(fā)生堿基錯(cuò)配位點(diǎn)時(shí),其構(gòu)象發(fā)生變化,招募MutL 形成修復(fù)復(fù)合體,對(duì)錯(cuò)配序列進(jìn)行修復(fù)[7-8]。
在大腸桿菌中,MutL 發(fā)揮內(nèi)切酶作用,在錯(cuò)配位置產(chǎn)生切口[9],阻斷DNA 鏈繼續(xù)合成。MutL 的DNA 結(jié)合位點(diǎn)突變會(huì)使MutL 無法結(jié)合在發(fā)生錯(cuò)誤的DNA 位點(diǎn),MMR 系統(tǒng)不能發(fā)揮正常功能,活性下降,錯(cuò)配序列無法修復(fù),顯著提高細(xì)菌的突變率[10-12]。在銅綠假單胞菌中,MutL 也具有DNA 切割活性,使發(fā)生錯(cuò)配的DNA 雙鏈斷裂,然后通過非同源端連接進(jìn)行DNA 修復(fù)。非同源端連接將提高染色體缺失的可能性,染色體的缺失導(dǎo)致銅綠假單胞菌產(chǎn)生棕色突變體,這種顏色的突變體可以防止噬菌體捕食[13]。在人和多數(shù)模式生物中,MutL 的功能已有廣泛研究[14-16],但其是否與病原菌的致病性相關(guān)還未見報(bào)道。
白葉枯病是影響水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害,由水稻黃單胞菌白葉枯致病變種(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)侵染所致[17]。Xoo致病力受很多因素調(diào)控,調(diào)控途徑也不相同,不同途徑間還有相互影響,是外界環(huán)境和內(nèi)在因素共同作用的結(jié)果[18]。目前的研究表明,基礎(chǔ)代謝、外源信號(hào)感應(yīng)與傳遞、分泌系統(tǒng)及其分泌蛋白是調(diào)控Xoo致病力的關(guān)鍵因素[19-20]。Xoo侵染水稻時(shí),水稻會(huì)產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng),產(chǎn)生大量有毒的物質(zhì)如活性氧等毒害病原菌[18],導(dǎo)致其突變?cè)黾?,生存受到挑?zhàn)[19]。病原菌要成功侵染必須要有高效的應(yīng)對(duì)措施。DNA 損傷修復(fù)是保證病原菌應(yīng)對(duì)外界環(huán)境不利影響的重要措施之一[9]。因此,MMR 應(yīng)該在此過程中起到非常重要的作用,但相關(guān)研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究MutL 是否參與XooDNA 錯(cuò)誤修復(fù)以及是否調(diào)控病原菌的致病力,旨在為白葉枯病的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。
1.1 菌株與質(zhì)粒PXO99A菌株和pK18mobSacB質(zhì)粒為筆者所在的實(shí)驗(yàn)室保存,大腸桿菌菌株購自全式金生物技術(shù)有限公司。
1.2 培養(yǎng)基與試劑PSA 培養(yǎng)基:1%胰蛋白胨、1%蔗糖、0.1%谷氨酸鈉;PGA 培養(yǎng)基:1%胰蛋白胨、1%葡萄糖、0.1% 谷氨酸鈉;PSSU 培養(yǎng)基:1%胰蛋白胨、15%蔗糖、0.1%谷氨酸鈉;LB 培養(yǎng)基:1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl;M4M 培養(yǎng)基:0.048% Na2HPO4、0.03% KH2PO4、0.05%檸檬酸鈉、0.1% (NH4)2SO4、0.05%酶水解酪素、0.02% MgSO4·7H2O、0.05%葡萄糖。固體培養(yǎng)基另加1.5%的瓊脂。DNA 凝膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。高保真DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶及T4 連接酶購自NEB 公司。其他試劑購自廣州化學(xué)試劑公司。
1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)基因兩端序列,運(yùn)用軟件Primer 5 分析、設(shè)計(jì)引物(表1),并由生工生物工程(廣州)分公司合成。
表1 本實(shí)驗(yàn)引物
1.4 mutL 突變體的構(gòu)建及致病力檢測(cè)PCR 擴(kuò)增mutL上下游各約500 bp 序列,分別用HindIII/BamHI 和BamHI/EcoRI 酶切后一起連接到經(jīng)HindIII/EcoRI 酶切的自殺性載體pK18mobSacB上,熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌,獲得pK18-mutL載體,測(cè)序正確后采用同源重組、兩次交換的方法構(gòu)建突變體。采取剪葉法,在TP309 水稻葉片上接種野生型菌株P(guān)XO99A和mutL突變體,14 d 后量取從剪口處到枯斑內(nèi)部邊界的長(zhǎng)度,統(tǒng)計(jì)病斑長(zhǎng)度與數(shù)量。
1.5 檢測(cè)Xoo 生長(zhǎng)速度
1.5.1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定PXO99A、△mutL菌株培養(yǎng)(PSA 培養(yǎng)基、28 ℃、180 r·min-1)36 h 后,按1∶100 轉(zhuǎn)接于10 mL PSA 中,用全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀每2 h 測(cè)定1 次OD600值。
1.5.2在缺陷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況將PXO99A、ΔmutL菌株用PSA 培養(yǎng)36 h,M4M 培養(yǎng)基清洗2 遍,調(diào)至OD600=1.0,再稀釋至10-7共8 個(gè)梯度,取2 μL 菌懸液點(diǎn)板(PSA 和M4M 固體培養(yǎng)基)28 ℃倒置培養(yǎng),2~3 d 拍照。
1.6 H2O2 誘導(dǎo)情況下Xoo突變率的測(cè)定PXO99A、ΔmutL菌株用PSA 培養(yǎng)36 h 后,1∶100轉(zhuǎn)接于500 mL PSA 中,待培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,ddH2O 清洗1 次,調(diào)OD600=1.0,取相同體積菌液,用終濃度40 mmol·L-1的H2O2處理菌液30 min,ddH2O 清洗過氧化氫2 遍,最后用6 mL ddH2O 重懸,取出100 μL 菌液稀釋到10-7、10-8后,稀釋液涂PSA 平板,計(jì)算菌落總數(shù)(A);其余菌液(5.9 mL)涂布于PSA 加利福平的平板上,28 ℃ 培養(yǎng)3 d,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)(B)。B 與A 的比值即為突變率。
1.7 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)mutL,產(chǎn)物回收后無縫克隆到HindIII/EcoRI 酶切的廣宿主載體pHM1 上。PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得的單菌落,對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序正確的質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)入到ΔmutL,獲得互補(bǔ)菌株(C-ΔmutL)。
2.1 mutL 缺失突變導(dǎo)致Xoo致病力下降以PXO99A為野生型菌株,經(jīng)過2 次同源重組后mutL基因被缺失突變。以mutL兩側(cè)引物進(jìn)行PCR,以PXO99A和ddH2O 作對(duì)照。如圖1-A 所示,mutL突變體的擴(kuò)增片段比野生型擴(kuò)增片段短,約1 800 bp,正好符合mutL基因片段大?。? 878 bp),表明mutL突變體(ΔmutL)構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步分析mutL的功能,構(gòu)建了mutL的互補(bǔ)菌株C-ΔmutL。將PXO99A、mutL突變體及其互補(bǔ)菌株接種TP309 水稻,結(jié)果顯示mutL突變體的病斑長(zhǎng)度比野生型及其互補(bǔ)菌株都短,野生型和互補(bǔ)菌株間沒有顯著差異(圖1-B、C)。說明mutL正調(diào)控Xoo的致病力。
圖1 mutL 突變體的構(gòu)建及其致病力分析
2.2 mutL 突變并不顯著影響Xoo的生長(zhǎng)MutL的功能是對(duì)細(xì)胞DNA 錯(cuò)配進(jìn)行修復(fù),維持細(xì)胞生命活動(dòng)的正常進(jìn)行,其突變可能改變其生長(zhǎng)。因此,本研究檢測(cè)了mutL突變是否影響Xoo的生長(zhǎng)速度。結(jié)果顯示,在豐富性培養(yǎng)基(PSA)和營(yíng)養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(M4M)中,ΔmutL的生長(zhǎng)速率都略低于PXO99A(圖2- A 和圖2-B),但沒有顯著差異。說明MutL 在正常情況下并不顯著影響Xoo的生長(zhǎng)。
2.3 MutL 參與XooDNA的應(yīng)急修復(fù)H2O2是常見的活性氧種類,與二價(jià)鐵離子發(fā)生Fenton反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物中的羥自由基具有極強(qiáng)的氧化能力,會(huì)對(duì)DNA 產(chǎn)生損傷。細(xì)胞MMR 系統(tǒng)可以修復(fù)損傷DNA,使其遺傳穩(wěn)定。但突變mutL后,MMR 系統(tǒng)受損,細(xì)胞DNA 修復(fù)功能會(huì)減弱,可能增加細(xì)菌的突變率。突變率通常采用菌株利福平抗性獲得率來表示[19]。因此,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型PXO99A和ΔmutL菌株進(jìn)行H2O2脅迫處理,然后涂布在含利福平的平板上生長(zhǎng)。3 d 后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與PXO99A相比,△mutL的突變率顯著增加(圖2- C),說明MutL參與Xoo的DNA 修復(fù)。
圖2 MutL 對(duì)Xoo 生長(zhǎng)和突變修復(fù)的調(diào)控作用
在病原菌侵染過程中,病菌自身會(huì)改變其代謝活性、毒素合成和分泌能力等,逃避宿主攻擊[18-20]。同時(shí)宿主在對(duì)抗病原菌時(shí)也會(huì)產(chǎn)生多種防御機(jī)制[21]。其中快速產(chǎn)生活性氧(ROS)限制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖是植物普遍的防御機(jī)制[21]。細(xì)菌成功侵染必須要快速適應(yīng)這種高ROS 環(huán)境。一方面,病原菌在感染植物過程中會(huì)誘發(fā)ROS 清除酶表達(dá),進(jìn)而清除ROS;另一方面,細(xì)菌會(huì)修復(fù)由ROS 帶來的損傷,包括DNA 和其他大分子物質(zhì),幫助病原菌適應(yīng)宿主環(huán)境并成功繁殖[21]。因此,DNA 損傷修復(fù)對(duì)病原菌成功侵染是重要的。在細(xì)菌中,MutL/MutS 系統(tǒng)是主要的修復(fù)系統(tǒng),其突變將導(dǎo)致細(xì)菌自發(fā)突變率增加、抗逆性降低、環(huán)境適應(yīng)能力減弱[3]。對(duì)病原菌而言,MutL/MutS 可能對(duì)病原菌適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境起到重要的作用。
本研究結(jié)果表明,mutL突變導(dǎo)致Xoo在水稻TP309 上的致病力降低(圖1),說明MutL 調(diào)控Xoo的侵染過程,是Xoo致病性相關(guān)的調(diào)節(jié)因子。同時(shí),在正常條件下(無論是在豐富型還是營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中),mutL突變都未顯著改變Xoo的生長(zhǎng)狀況(圖2),說明MutL 可能不是直接調(diào)控細(xì)菌生長(zhǎng)來影響其致病力的。如前所述,在侵染過程中植物會(huì)釋放大量ROS 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和DNA 造成損傷[21]。本研究結(jié)果也顯示,ROS 增多導(dǎo)致mutL突變體的突變率急劇增加(圖2)。這暗示MutL 調(diào)控Xoo致病力可能是由于其修復(fù)DNA 能力降低導(dǎo)致的,但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
在大腸桿菌中,mutL突變后自發(fā)突變率比野生型高300 倍[22]。分支桿菌mutL突變也導(dǎo)致自發(fā)突變率增加4 倍[23]。同樣,缺失mutL的耐輻射奇球菌的自發(fā)突變率也增加了16 倍[24]。然而,本研究在Xoo中并未檢測(cè)到野生型和mutL突變體自發(fā)突變率的差異,暗示Xoo中可能存在其他主要的DNA 修復(fù)系統(tǒng),而MutL 是否只有在逆境環(huán)境中才發(fā)揮功能,需進(jìn)一步研究證實(shí)。