周 颯，林 洋，祖海月，王金花

（海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，?？?570228）

蜱蟲(chóng)是一種專(zhuān)性吸血的體外寄生蟲(chóng)，它們可以從包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和爬行動(dòng)物身上吸血，從而傳播各種疾病，被認(rèn)為是僅次于蚊子的重要傳播媒介。它們傳播的病原體種類(lèi)很廣，包括病毒、細(xì)菌、立克次體、原蟲(chóng)，甚至某些蠕蟲(chóng)（微絲蚴）[1-2]。無(wú)形體（Anaplasma）是經(jīng)由蜱媒傳播的一種革蘭氏陰性菌，隸屬于立克次體目（Rickettsiales）無(wú)形體科（Anaplasmataceae），目前常見(jiàn)的無(wú)形體有7 種，分別是嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體（Anaplasma pagocytophilum）、牛無(wú)形體（Anaplasma bovis）、綿羊無(wú)形體（Anaplasma ovis）、山羊無(wú)形體（Anaplasma capra）、扁平無(wú)形體（Anaplasma platys）、邊緣無(wú)形體（Anaplasma marginale）及中央無(wú)形體（Anaplasma centrale）。

20 世紀(jì)90 年代初，在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)了人粒細(xì)胞無(wú)形體病的確診病例[3]。2006 年在我國(guó)安徽省

也出現(xiàn)了該病例，并發(fā)現(xiàn)該病原可通過(guò)HGA 患者血液或呼吸道分泌物進(jìn)行傳播[4]。牛無(wú)形體主要分布在非洲、亞洲和南美洲。牛和水牛被認(rèn)為是牛無(wú)形體的主要宿主，但在我國(guó)的犬中也發(fā)現(xiàn)了牛無(wú)形體的存在[5]。扁平無(wú)形體主要侵染犬的血小板，引起犬傳染性循環(huán)血小板減少癥。1978 年Harvey 和他的同事在美國(guó)佛羅里達(dá)州的一例犬感染中首次描述了這種疾病[6]。有研究表明血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineus）是扁平無(wú)形體的生物媒介[7]。扁平無(wú)形體在血蜱和犬中廣泛流行，美國(guó)、阿根廷、巴西、格林納達(dá)、智利、海地、意大利、葡萄牙、馬來(lái)西亞等國(guó)家和中國(guó)臺(tái)灣省均有報(bào)道[8-19]；在阿爾及利亞的家畜中[20]、中國(guó)的山羊[21]和貓[22]中也檢測(cè)到了扁平無(wú)形體；一些南美和加勒比國(guó)家[23-24]也有報(bào)道人被扁平無(wú)形體感染的案例。由此可見(jiàn)，扁平無(wú)形體對(duì)包括人類(lèi)在內(nèi)的廣泛宿主物種構(gòu)成威脅。

無(wú)形體病是一種蜱傳疾病，主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)流行，不僅會(huì)對(duì)家畜的健康和生產(chǎn)力造成嚴(yán)重的影響，還會(huì)威脅到人類(lèi)的健康。該病已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B 類(lèi)動(dòng)物傳染病，也被我國(guó)農(nóng)業(yè)部列為進(jìn)出口動(dòng)物檢疫項(xiàng)目之一[25]。海南全年暖熱，雨量充沛，植被豐富，適合蜱類(lèi)生長(zhǎng)，目前海南省硬蜱有6 屬20 種，并且是斑點(diǎn)熱的疫源地[26]。但迄今為止，海南省乃至中國(guó)對(duì)于犬寄生蜱及其攜帶的病原報(bào)道較少。另外，隨著寵物數(shù)量的劇增，寵物蜱傳人獸共患病的發(fā)病率也不斷升高，有研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)寵物的人被蜱叮咬的可能性約為不養(yǎng)寵物的人的1.5 倍[27]，因此，探究海南犬寄生蜱種類(lèi)及其攜帶扁平無(wú)形體的情況，有助于進(jìn)一步了解海南犬蜱的分類(lèi)組成，可為動(dòng)物寄生蜱種類(lèi)分布及預(yù)防蜱傳疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源及其處理樣本從海南省白沙、樂(lè)東、定安、屯昌4 個(gè)地區(qū)的犬體表獲得，主要使用宿主體表檢查法，著重檢查犬只易被蜱蟲(chóng)叮咬的部位，如犬耳、頸部、腋窩、胸部、腹股溝、肛周、腿跟等易感染部位，發(fā)現(xiàn)蜱蟲(chóng)后，使用鑷子夾住蜱蟲(chóng)的頭部并將其放入干凈的離心管中。共采集犬體表寄生蜱蟲(chóng)546 只。將采集到的蜱蟲(chóng)用75%酒精漂洗3～5 次，洗去表面雜質(zhì)，再用滅菌蒸餾水沖洗3 次后放入75%酒精的樣本管中保存。

1.2 試劑及儀器主要試劑：2×TaqPlus Master MixII(Dye Plus)購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司；Goldview 染料購(gòu)自蘇州金唯智生物科技有限公司；瓊脂糖、動(dòng)物基因組DNA 提取試劑盒；DNA Marker 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主 要 儀 器：PCR 儀（TProfessional）購(gòu) 自 德 國(guó)Biometra 公司，小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5415R）購(gòu)自Eppendorf 公司，體視顯微鏡購(gòu)自Saike Digital 公司，瓊脂糖水平電泳儀（Mini-PROTEAN Tetra）購(gòu)自北京六一儀器廠(chǎng)，凝膠成像分析系統(tǒng)（GEL DOC XR+）購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司。

1.3 蜱的形態(tài)學(xué)鑒定參照中國(guó)畜禽外寄生蟲(chóng)形態(tài)分類(lèi)彩色圖譜，用體視顯微鏡對(duì)蜱蟲(chóng)進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定，主要觀(guān)察蜱蟲(chóng)的假頭基、盾板、氣門(mén)板、生殖孔、肛側(cè)板、肛溝和基節(jié)等具有形態(tài)學(xué)鑒定意義的部位，最終確定蜱蟲(chóng)種類(lèi)并拍攝相應(yīng)的圖片。

1.4 DNA 提取取出上述經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定的蜱蟲(chóng)，每只放入1.5 mL 離心管中，再用ddH2O 反復(fù)沖洗，去除表面雜質(zhì)，干燥后將蜱蟲(chóng)磨碎，再參照動(dòng)物基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蜱蟲(chóng)DNA，并于-20 ℃保存。

1.5 PCR 檢測(cè)查找蜱種鑒定及無(wú)形體檢測(cè)相關(guān)的引物序列送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成，本研究使用的引物信息見(jiàn)表1。嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體和牛無(wú)形體使用巢氏PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。扁平無(wú)形體和牛無(wú)形體使用常規(guī)PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上游引物（濃度10 pmol·μL-1）0.5 μL，下游引物（濃度10 pmol·μL-1）0.5 μL，基因組DNA（～20 ng）1 μL。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR 產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀(guān)察是否有目的條帶，并拍照保存。將所獲得的陽(yáng)性產(chǎn)物送往廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息

表2 PCR 擴(kuò)增條件

1.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建使用NCBI中BLAST 在線(xiàn)比對(duì)工具將蜱種鑒定及扁平無(wú)形體的測(cè)序結(jié)果與GenBank 中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用DNAMAN 8.0 基因分析軟件進(jìn)行同源性分析，使用Mega X 軟件，選擇Neighbor-joining（NJ）算 法 中 的Kimura-2-parameter 參 數(shù) 模 型，Bootstrop 值選擇1 000 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱的形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，546 只犬寄生蜱均屬于扇頭蜱屬中的血紅扇頭蜱，其中雌蜱265 只，雄蜱281 只。蜱蟲(chóng)外部形態(tài)觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 血紅扇頭蜱外部形態(tài)

2.2 蜱的分子生物學(xué)鑒定及種系發(fā)育分析犬寄生蜱的16SrDNA基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖2，擴(kuò)增片段為460 bp，與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致。通過(guò)序列比對(duì)之后，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中所有蜱蟲(chóng)均為血紅扇頭蜱，與Genbank 中已有的蜱種參考株Rhipicephalus sanguineus（登錄號(hào)為MG651947）的同源性為100%，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符。用MEGA-X 軟件選擇本實(shí)驗(yàn)中獲得的代表性血紅扇頭蜱線(xiàn)粒體16SrDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3），分析結(jié)果表明序列HN-01 和HN-02 處于不同的遺傳進(jìn)化分支，HN-01 與已知的來(lái)自美國(guó)的血紅扇頭蜱(MH018842)處于同一分支，HN-02 與來(lái)自泰國(guó)的血紅扇頭蜱（KC170744）處于同一分支，與我國(guó)甘肅省、北京市所獲得的血紅扇頭蜱（JF979377、KC203362）序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 16S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

圖3 基于16S rDNA 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 犬蜱攜帶無(wú)形體的PCR 檢測(cè)結(jié)果筆者在犬體表蜱中未檢測(cè)到嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體和牛無(wú)形體，只發(fā)現(xiàn)了犬蜱中攜帶有扁平無(wú)形體。犬體表蜱3 種無(wú)形體感染率見(jiàn)表3。犬蜱攜帶扁平無(wú)形體gltA基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在580 bp 處出現(xiàn)目的片段，與預(yù)期片段大小相符。擴(kuò)增序列測(cè)序后經(jīng)Blast 比對(duì)后與GenBank 上已有的扁平無(wú)形體序列同源性為100%。

表3 3 種無(wú)形體感染率

圖4 gltA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

3 討 論

3.1 犬體表蜱種蜱蟲(chóng)是犬只常見(jiàn)的外寄生蟲(chóng)，研究報(bào)道，有多種蜱類(lèi)可以寄生在犬的體表，如血紅扇頭蜱(Rhipicephalus sanguineus)、長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalis Iongicornis)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、草 原 血 蜱(Haemaphysalis verticalis)、圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalus turanicus)、鈴頭血蜱(Haemaphysalis campanulata)等，但由于各地地理環(huán)境不同，其優(yōu)勢(shì)蜱種也不同。宋勝男等[32]在2021 年通過(guò)PCR 檢測(cè)的方法鑒定出石河子地區(qū)寵物犬體表436 只圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalus turanicus)，它也是新疆地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種。張艷等[33]在2021 年通過(guò)PCR 的方法鑒定出河南犬體表2 只長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalis Iongicornis)，1 只褐黃血蜱(Haemaphysalis flava)。張儉偉等[34]在2017 年統(tǒng)計(jì)了我國(guó)中東地區(qū)20 個(gè)城市寵物犬體表蜱蟲(chóng)種類(lèi)，其中杭州、福州、廣州、廈門(mén)、深圳、南寧、青島、太原和長(zhǎng)沙地區(qū)為血紅扇頭蜱；鄭州、石家莊、濟(jì)南和重慶地區(qū)為長(zhǎng)角血蜱；上海、北京、天津、西安和寧波地區(qū)則均存在血紅扇頭蜱與長(zhǎng)角血蜱。陳紹基等[35]在2020 年通過(guò)PCR 檢測(cè)出重慶市榮昌區(qū)中華田園犬體表有長(zhǎng)角血蜱。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定出犬體表寄生蜱均為血紅扇頭蜱，與國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)犬體表蜱蟲(chóng)鑒定結(jié)果一致[36-38]。血紅扇頭蜱對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛分布于世界各地[39]，它也是犬最常見(jiàn)的寄生蜱種。本次調(diào)查結(jié)果顯示蜱種種類(lèi)分布較為單一，這也證明了血紅扇頭蜱是犬的優(yōu)勢(shì)蜱種，這一方面是因?yàn)檠t扇頭蜱本身屬于熱帶物種，海南島炎熱的氣候條件為其提供了良好的生存環(huán)境；另一方面可能是由于采樣點(diǎn)的局限性造就了單一蜱種，因此，要獲得更豐富的犬寄生蜱種類(lèi)資料，還需要擴(kuò)大采樣范圍及樣本數(shù)量。

基于蜱蟲(chóng)16SrDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，本試驗(yàn)中所得到的HN-01 和HN-02 序列處于同一大的分支上，但分別聚集在不同的小分支上，HN-01 序列與美國(guó)所得到的血紅扇頭蜱同源性較高，HN-02 序列與泰國(guó)的血紅扇頭蜱同源性較高，然而2 個(gè)序列與國(guó)內(nèi)甘肅、河北等地的血紅扇頭蜱親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這可能是由于海南獨(dú)特的地理位置造成蜱種地域差異性。

3.2 犬體表蜱攜帶無(wú)形體在國(guó)內(nèi)外，關(guān)于蜱蟲(chóng)感染無(wú)形體的報(bào)道有很多。Hosseini 等[40]在伊朗不同的地理區(qū)域分別鑒定出亞洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)、單峰駝璃眼蜱(H.dromedarii)、血紅扇頭蜱(Rhipicephalus sanguineus)和牛蜱(Boophilus)，并在牛蜱中獲得一條邊緣無(wú)形體序列和在血紅扇頭蜱中獲得2 條綿羊無(wú)形體序列。Qin 等[41]調(diào)查了我國(guó)山東省膠南市長(zhǎng)角血蜱中無(wú)形體的感染率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體、牛無(wú)形體和山羊無(wú)形體的感染率分別為0.10%、1.55%和0.33%。然而，在我國(guó)集中于犬體表寄生蜱攜帶無(wú)形體的調(diào)查研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)采集的所有犬體表蜱蟲(chóng)進(jìn)行無(wú)形體16SrRNA和gltA基因的PCR 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)扁平無(wú)形體陽(yáng)性率為1.1%（6/546），未檢測(cè)到嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體和牛無(wú)形體。2018 年韓宏曉等[36]通過(guò)PCR 的方法鑒定出上海地區(qū)寵物犬體表的血紅扇頭蜱，并對(duì)蜱蟲(chóng)攜帶嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果也未檢測(cè)到，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Yuasa[19]在2017 年用PCR 檢測(cè)的方法調(diào)查了臺(tái)灣省犬體表寄生血紅扇頭蜱攜帶扁平無(wú)形體的陽(yáng)性率為3.6% (11/306），這一結(jié)果高于本實(shí)驗(yàn)調(diào)查得到的扁平無(wú)形體陽(yáng)性率。盡管本試驗(yàn)中檢測(cè)到的犬蜱感染扁平無(wú)形體的陽(yáng)性率較低，但是這也間接反應(yīng)了犬只本身感染扁平無(wú)形體的情況，這也需要后續(xù)對(duì)犬只進(jìn)行更加深入的調(diào)查。

此外，我國(guó)養(yǎng)寵家庭逐年上升，犬作為一種伴侶動(dòng)物并且與人類(lèi)的活動(dòng)息息相關(guān)，二者均存在被蜱叮咬并感染蜱傳疾病的危險(xiǎn)。雖然扁平無(wú)形體還未被公認(rèn)為是一種人獸共患病原，但已有感染人的記錄。據(jù)報(bào)道，在委內(nèi)瑞拉的2 名女性患者中檢測(cè)到扁平無(wú)形體的病原[23]。為了避免蜱蟲(chóng)叮咬及感染蜱傳疾病的危險(xiǎn)，犬主應(yīng)加強(qiáng)對(duì)犬只的行為約束，避免帶犬只去野外或草地玩耍，另外也應(yīng)定期對(duì)犬只進(jìn)行衛(wèi)生管理，定期驅(qū)蟲(chóng)，做好防蜱滅蜱工作。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)海南部分地區(qū)犬體表寄生蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果全為血紅扇頭蜱。并通過(guò)PCR 的方法對(duì)蜱蟲(chóng)進(jìn)行了無(wú)形體的檢測(cè)，結(jié)果表明犬體表蜱攜帶扁平無(wú)形體的陽(yáng)性率為1.1%（6/546），沒(méi)有檢測(cè)到嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體和牛無(wú)形體。