呂鑫 ，顧志榮 ，祁梅 ，郭燕 ，毛小文 ，葛斌

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是以起病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為全面性認(rèn)知功能損傷[1]。調(diào)查顯示，我國60歲及以上人群中AD患者約占癡呆癥患者的65.23%，已成為我國嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一[2]。AD主要病理表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑、Tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)、炎癥反應(yīng)等[3]。研究表明，Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體是誘發(fā)動脈粥樣硬化、2型糖尿病、AD等疾病的危險因素，活性氧（ROS）是NLRP3炎性小體激活的經(jīng)典途徑[4]，NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的關(guān)鍵酶，由膜亞基gp91phox、p22phox和胞漿亞基p47phox、p67phox等組成（phox表示來源于吞噬細(xì)胞）。當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時，上述亞基不具備活性；當(dāng)受到刺激后，各亞基在細(xì)胞膜上集合與裝配，形成有活性的NADPH氧化酶復(fù)合體，催化生成大量ROS，進(jìn)一步激活NLRP3炎性小體，釋放炎癥因子[5]。因此，以NADPH氧化酶各亞基為切入點(diǎn)，減少ROS生成，進(jìn)而抑制炎癥因子釋放，可實現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD由腎精不足、腦髓漸空所致[6]。鎖陽是中醫(yī)、蒙醫(yī)常用補(bǔ)腎益精藥，其有效部位鎖陽黃酮具有抗氧化[7]、延緩衰老[8]、清除自由基及抗癌[9]等多種藥理活性。研究表明，鎖陽提取物具有防治AD的潛能[10-11]。本研究觀察鎖陽黃酮對AD大鼠海馬組織ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表達(dá)的影響，為AD防治提供新思路和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性Wistar大鼠70只，4月齡，體質(zhì)量（250±50）g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2020-0002，動物使用許可證號SYXK（甘）2020-0006。飼養(yǎng)于甘肅省藥品檢驗研究院SPF級動物實驗室，溫度（20±2）℃，濕度35%～55%，12 h光照/黑暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物及制備

鎖陽，2021年3月采集于內(nèi)蒙古，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為鎖陽Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖。將新鮮鎖陽晾至完全干透，粉碎，過2號篩，60 ℃烘干，加12倍量65%乙醇，80 ℃回流提取2 h，趁熱過濾，濾液濃縮至無醇味，用HPD-826型大孔吸附樹脂對提取物進(jìn)行動態(tài)吸附，將洗脫液濃縮，真空干燥，得到純化后的鎖陽黃酮（純度88.86%），用生理鹽水分別配制成濃度為 2.5、5、10 mg/mL 溶液。Aβ1-42（批號04010011827），強(qiáng)耀生物科技有限公司，將1 mg Aβ1-42凍干粉溶于50 μL DMSO中，加水至200 μL，稀釋成5 μg/μL，分裝，避光貯存于-80 ℃冰箱備用。鹽酸多奈哌齊（批號2010023），衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，用生理鹽水配制成0.05 mg/mL水溶液。

1.3 主要試劑與儀器

DAB試劑盒（貨號ZLI-9018），北京中杉金橋；ROS試劑盒（貨號ZC-36726），上海茁彩；BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0009），上海碧云天；Aβ1-42抗體（貨號25524-1-AP），武漢三鷹；gp91phox抗體（貨號A1636）、p47phox抗體（貨號A1148）、p67phox抗體（貨號A3703）、NLRP3抗體（貨號A5652）、β-actin抗體（貨號AC026），武漢愛博泰克；白細(xì)胞介素（IL）-1β抗體（貨號bs-0812r）、p22phox抗體（貨號bs-3879r），北京博奧森。大鼠腦立體定位儀（型號WT-200）、Morris水迷宮（型號MT-200），成都泰盟；數(shù)字切片掃描儀（型號Pannoramic 250），匈牙利3DHIESTECH公司；酶標(biāo)儀（型號SpectraMAX Plus384），上海美谷；化學(xué)發(fā)光成像儀（型號5200），上海天能科技；RT-PCR儀（型號QuantStudioTM3），美國賽默飛。

1.4 造模

70只大鼠隨機(jī)選取10只作為空白組、10只作為假手術(shù)組，剩余50只大鼠進(jìn)行造模。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉大鼠，頭部備皮，縱行切口，暴露前囟門，參照腦立體定位坐標(biāo)[12]確定海馬位置（前囟后沿中線移3.0 mm，左右各旁開2.2 mm，硬腦膜下深3 mm），用牙科鉆在顱骨上鉆孔（直徑約1 mm），用微量進(jìn)樣器在雙側(cè)海馬分別注射Aβ1-42溶液1 μL，留針5 min，緩慢退針。于傷口處撒適量青霉素，縫合皮膚，碘伏消毒，單籠飼養(yǎng)?？瞻捉M不予任何處理，假手術(shù)組注射等體積生理鹽水。

1.5 分組及給藥

將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、多奈哌齊組及鎖陽黃酮低、中、高劑量組，每組10只。術(shù)后3 d開始給藥，多奈哌齊組予多奈哌齊溶液0.5 mg/kg灌胃，鎖陽黃酮低、中、高劑量組分別予鎖陽黃酮溶液25、50、100 mg/kg灌胃，體積1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)28 d?？瞻捉M、假手術(shù)組及模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.6 行為學(xué)檢測

從給藥第21天開始，通過Morris水迷宮實驗[13]評價大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。包括定位航行（21～25 d）和空間探索（26 d）兩部分，分別記錄大鼠末次60 s內(nèi)逃避潛伏期、跨平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間。

1.7 取材

末次行為學(xué)檢測結(jié)束后，采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，股動脈取血，靜置2 h，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存，用于ELISA檢測。取血后脫頸處死大鼠，3只取全腦于4%多聚甲醛中固定，用于HE及免疫組化染色；剩余大鼠冰上迅速取腦并分離雙側(cè)海馬組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于ELISA、Western blot及RT-PCR檢測。

1.8 HE染色

固定的腦組織經(jīng)全自動脫水機(jī)脫水后，石蠟包埋，切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。

1.9 免疫組化染色

腦組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片后，進(jìn)行抗原修復(fù)、血清封閉，滴加Aβ1-42一抗（1∶50），4 ℃孵育過夜，滴加二抗，常溫孵育1 h，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，以黃色或棕黃色為陽性表達(dá)，使用Halo數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)計算每張圖像陽性面積占比。

1.10 ELISA檢測

取海馬組織及血清，海馬組織按質(zhì)量/體積比1∶9加入PBS，使用組織研磨儀進(jìn)行勻漿，勻漿液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定海馬組織及血清ROS含量。

1.11 Western blot檢測

取海馬組織，加入3 mm鋼珠及RIPA裂解液，置于-20 ℃高速低溫組織研磨儀內(nèi)研磨4次，每次60 s，4 ℃冰箱裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。按4∶1比例加入5×loading buffer，混勻后熱循環(huán)儀95 ℃、15 min進(jìn)行蛋白變性。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，滴加gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、IL-1β、NLRP3 一抗（1∶2 000）和β-actin一抗（1∶100 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育2～3 h。超敏ECL曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.12 RT-PCR檢測

TRIzol法提取海馬組織總RNA，測定RNA濃度，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。配制PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸，采集熒光30 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA表達(dá)量。引物由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，組間比較用方差分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett's T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鎖陽黃酮對模型大鼠行為學(xué)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.01），跨平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）、跨平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間明顯增加（P<0.05，P<0.01），鎖陽黃酮低劑量組大鼠目標(biāo)象限停留時間明顯增加（P<0.05），鎖陽黃酮中劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）、目標(biāo)象限停留時間明顯增加（P<0.01），鎖陽黃酮高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）、跨平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗學(xué)習(xí)記憶能力比較（±s）

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗學(xué)習(xí)記憶能力比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組只數(shù)10 10 10 10 10 10 10逃避潛伏期/s 16.42±3.42 17.69±6.04 37.37±4.76**20.17±4.81&&34.54±7.82 25.12±4.12&&19.52±4.54&&跨平臺次數(shù)4.9±2.02 5.6±2.07 1.8±1.23**3.8±1.81&2.6±1.58 3.1±1.73 3.7±2.00&目標(biāo)象限停留時間/s 28.07±7.01 33.01±9.44 10.59±3.48**25.13±8.77&&18.20±8.28&21.75±5.83&&22.88±7.58&&

2.2 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

空白組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列正常，未見明顯細(xì)胞壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生及炎性細(xì)胞浸潤；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)染色加深，胞核邊界不清晰，局部錐體細(xì)胞排列紊亂；與模型組比較，多奈哌齊組及鎖陽黃酮中、高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較正常，凋亡等病理形態(tài)有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.3 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織β淀粉樣蛋白1-42表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)明顯降低（P<0.05）。見圖2、表3。

表3 各組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)比較（±s，%）

表3 各組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，&P<0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3陽性面積比0.21±0.05 0.32±0.01 11.72±1.34*3.44±0.79&8.93±1.81 6.97±0.63 5.14±0.54&

圖2 各組大鼠海馬組織Aβ1-42陽性表達(dá)（免疫組化染色，標(biāo)尺=100 μm）

2.4 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織和血清活性氧含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織和血清ROS含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織和血清ROS含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見表4。

表4 各組大鼠海馬組織和血清ROS含量比較（±s，U/mL）

表4 各組大鼠海馬組織和血清ROS含量比較（±s，U/mL）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組海馬組織只數(shù)6 6 6 6 6 6 6 ROS 17.09±3.87 15.74±6.03 33.30±7.62**23.35±5.49&&35.49±3.36 35.77±3.64 26.65±5.19&&血清只數(shù)10 10 10 10 10 10 10 ROS 20.40±2.82 20.06±6.44 37.37±7.25**22.88±8.22&31.11±4.93 29.34±7.15 26.19±4.17&&

2.5 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和Nod樣受體蛋白3、白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)升高（P<0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）。見表5、圖3。

表5 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3 gp91phox 1.00±0.00 1.03±0.21 8.71±0.96**2.16±0.46&&4.59±0.56&&2.93±0.29&&2.11±0.26&&p22phox 1.00±0.00 0.93±0.06 5.72±0.91**2.31±0.32&&4.01±0.14&&3.66±0.08&&2.22±0.33&&p47phox 1.00±0.00 1.08±0.11 3.29±0.18**1.44±0.18&&2.64±0.39&&2.01±0.26&&1.47±0.10&&p67phox 1.00±0.00 0.99±0.03 3.99±0.21**1.63±0.16&&3.09±0.51 2.60±0.51 1.65±0.15&&NLRP3 1.00±0.00 1.00±0.03 8.26±0.48**1.92±0.28&&6.45±0.46 3.25±0.32&&1.89±0.03&&IL-1β 1.00±0.00 1.06±0.10 4.29±0.30**2.06±0.02&3.67±0.42 2.85±0.21&2.09±0.05&

2.6 鎖陽黃酮對模型大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01，P<0.05）。見表6。

表6 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽黃酮低劑量組鎖陽黃酮中劑量組鎖陽黃酮高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3 gp91phox 1.00±0.04 0.83±0.09 13.01±1.78*2.28±0.16&9.62±0.21 4.90±0.21 2.31±0.06&p22phox 1.00±0.10 1.00±0.07 2.42±0.19**1.31±0.03&&1.96±0.17&&1.61±0.11&&1.49±0.07&&p47phox 1.02±0.25 0.38±0.03 12.15±0.78**2.00±0.13&&6.72±0.26&3.72±0.25&&2.39±0.10&&p67phox 1.00±0.04 0.60±0.10 9.46±0.67**1.73±0.15&&7.04±0.48 3.30±0.06&1.88±0.21&&

3 討論

目前AD臨床治療包括心理、環(huán)境及藥物干預(yù)等手段，臨床效果有待進(jìn)一步提高。中藥及其有效部位能通過多通路、多靶點(diǎn)保護(hù)神經(jīng)功能，療效及安全性較好，如人參皂苷[14]、刺參多糖[15]、紅景天苷[16]等是近年來AD防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)化合物。

氧化損傷和炎癥反應(yīng)是AD的關(guān)鍵致病因素。NADPH氧化酶與ROS生成密切相關(guān)，Aβ與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用后可激活NADPH氧化酶，繼而產(chǎn)生大量ROS，提示Aβ介導(dǎo)的NADPH氧化酶-ROS途徑在AD過程中發(fā)揮重要作用。NADPH氧化酶活性主要通過膜亞基gp91phox、p22phox和胞漿亞基p47phox、p67phox表達(dá)量來反映，其中p47phox和p67phox在各種刺激引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起始動性及樞紐性作用，而gp91phox和p22phox亞基是NADPH氧化酶蛋白家族的關(guān)鍵成員。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織NADPH氧化酶亞基gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox蛋白和mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，而經(jīng)多奈哌齊和高劑量鎖陽黃酮干預(yù)后，NADPH氧化酶各亞基蛋白和mRNA表達(dá)均明顯降低，提示多奈哌齊和鎖陽黃酮可通過抑制NADPH氧化酶各亞基表達(dá)降低ROS水平。目前，關(guān)于ROS介導(dǎo)NLRP3炎性小體活化的觀點(diǎn)逐漸被認(rèn)可[17]。研究顯示，ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸可顯著降低癡呆大鼠海馬組織NLRP3和IL-1β蛋白水平[18]，表明ROS產(chǎn)生是促進(jìn)NLRP3炎性小體激活的重要機(jī)制。本研究中，模型組大鼠海馬組織和血清ROS含量均明顯增加、海馬組織NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高，鎖陽黃酮高劑量組大鼠海馬組織及血清ROS含量明顯減少、海馬組織NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低，提示其能通過抑制ROS產(chǎn)生，進(jìn)而抑制NLRP3和IL-1β表達(dá)。

綜上，鎖陽黃酮可改善AD大鼠海馬組織病理形態(tài)，下調(diào)ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表達(dá)，降低Aβ毒性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。