許志勇，李 雯，姜本政，信淑珍，朱 雯

（1.黑龍江省寶清縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黑龍江 寶清 155600；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036）

維生素A（視黃醇）對于機(jī)體多種生理過程至關(guān)重要，包括視力、免疫功能、生殖、胚胎發(fā)育以及細(xì)胞生長和分化［1］。視黃醇代表牛血中最豐富的類視黃醇［2］，即使給動(dòng)物喂食不含維生素A 的飼料，其在公牛機(jī)體中的水平也至少可以維持145 d［3］。母牛和奶牛的血清視黃醇和β-胡蘿卜素水平在妊娠結(jié)束時(shí)下降，分娩時(shí)達(dá)到最低值，并在哺乳的第1 周再次增加［4］。血清視黃醇濃度的降低可能是由于大量視黃醇及其衍生物轉(zhuǎn)移到初乳中，導(dǎo)致類視黃醇在初乳中激增。

類視黃醇是分子量小的疏水性化合物，因此需要與可溶性蛋白質(zhì)結(jié)合。視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）是負(fù)責(zé)血漿視黃醇轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，并以1∶1 的比例與視黃醇結(jié)合。據(jù)報(bào)道RBP4 在小鼠中誘導(dǎo)胰島素抵抗［5］，并且人類血清RBP4 水平與葡萄糖耐量降低或2 型糖尿病患者的胰島素抵抗程度相關(guān)。STRA6 被鑒定為RBP4 的細(xì)胞表面受體［6］，表明RBP4 是一種新型的生物活性因子。但RBP4 在反芻動(dòng)物機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)情況尚不明確，尤其是在奶牛初乳中是否存在RBP4，其調(diào)控方式是否與類視黃醇相似不明確。本試驗(yàn)檢測了圍產(chǎn)期奶牛血清、初乳和常乳中RBP4和視黃醇濃度以及血清中INS 含量，以評估反芻動(dòng)物血漿RBP4 和視黃醇水平的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 血清、初乳及常乳的收集

在黑龍江省某集約化牛場隨機(jī)選取體重450～550 kg 的未懷孕、未哺乳的荷斯坦奶牛（n=30），檢查未進(jìn)食前血清RBP4、視黃醇和INS 水平。清晨未進(jìn)食前從頸靜脈收集血液，離心（1500 r∕min）收集上清液后再離心（12000 r∕min）分離血清，并于-30 ℃保存。在同一牛場隨機(jī)選取懷孕的荷斯坦奶牛（n=30）。產(chǎn)犢前3～6 d，分娩當(dāng)天以及產(chǎn)犢后7 d 和14 d 收集血清和乳清樣品。離心后-30 ℃保存。

1.2 血清和乳清中RBP4 的蛋白質(zhì)印跡分析

參考文獻(xiàn)［7］純化牛RBP4，將純化的RBP4 免疫獲得血清抗體。血清用蒸餾水稀釋20 倍，乳清用蒸餾水稀釋10 倍。通過常規(guī)SDS-PAGE 電泳試驗(yàn)（13%的濃縮膠）同時(shí)分離血清（7.5 mL）、乳清（24 mL）及純化后的RBP4。將蛋白質(zhì)電印跡轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（ImmobilonTM，Millipore，Bedford MA，USA）上。將膜在5%（W∕V）脫脂乳中封閉1 h，然后與抗RBP4 血清（1∶2000）在緩沖液中孵育48 ℃。用洗滌緩沖液洗滌5 次，并與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗 兔IgG 抗 體（1∶4000，Zymed Laboratories Inc.，South San Francisco CA，USA）在室溫下孵育1 h。使用Image 程序以光密度法分析免疫反應(yīng)條帶的表達(dá)強(qiáng)度。通過比較條帶灰度與純化的RBP4 強(qiáng)度來測量RBP4 濃度。

1.3 分光光度法測定血清和乳清中的視黃醇

通過文獻(xiàn)［8］描述的方法測定血清，將50 mL 乙醇和150 mL 己烷加入50 mL 血清和乳清中，混合40 min，并在12000 r∕min 離心10 min 后回收己烷。基于己烷提取物在325 nm 和453 nm 處的吸光度計(jì)算視黃醇濃度。

1.4 血清中INS 的檢測

利用商用INS 的ELISA 試劑盒（上海酶免公司）檢測試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ逯蠭NS 含量，根據(jù)說明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果表示為“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（SEM）”。雙向重復(fù)測量ANOVA，其中P＜0.05 被認(rèn)為差異顯著。利用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBP4 蛋白純化表達(dá)情況

如圖1 所示，純化的牛RBP4 條帶強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量密切相關(guān)，將10～80 ng 的RBP4 添加到牛血清和乳清后，純化的RBP4 分別以（96.2 ± 0.4）%和（95.4± 0.8）%回收。組間和組內(nèi)差異小于5.1%和2.4%，表明純化的牛RBP4 可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 Western blot 對RBP4 的定量分析

2.2 分娩前后血清RBP4 和視黃醇水平變化

分娩前3～6 d血清RBP4水平為（50.7±5.3）μg∕mL，與對照組相比無顯著差異。分娩當(dāng)天，RBP4 濃度顯著下降［（29.8±5.4）μg∕mL］，但分娩后14 d 恢復(fù)到產(chǎn)前水平［（52.1±2.1）μg∕mL］（圖2A）。分娩前血清視黃醇水平為（26.6±3.3）μg∕dL，與對照組相當(dāng)。與RBP4 相似，分娩當(dāng)天視黃醇水平顯著降低［（18.5±2.7）μg∕dL］，分娩后15 d［（33.9±4.3）μg∕dL］恢復(fù)到基礎(chǔ)水平（圖2B）。分娩前后的視黃醇∕RBP4 比值無顯著差異（圖2C）。

圖2 分娩前后奶牛血漿RBP4 和視黃醇水平的變化

2.3 分娩前后乳清中RBP4 和視黃醇水平的變化

在分娩前3～6 d 乳清中未檢測到RBP4 表達(dá)。在初乳中，RBP4 濃度為（16.4±5.6）μg∕mL（圖3A）。分娩后第7 天和第15 天，RBP4 從乳清中消失。乳清中視黃醇濃度［（分娩后7 d 為（43.5±6.9）μg∕dL］與血清視黃醇濃度相當(dāng)，但初乳中的視黃醇濃度顯著升高［（295.3±5.9）μg∕dL］。初乳中視黃醇與RBP4的摩爾比為20∶1。

2.4 血清中INS表達(dá)情況及其與RBP4相關(guān)性分析

分娩前3～6 d血清INS水平為（0.32±0.01）ng∕mL，與對照組相比，無顯著差異。分娩當(dāng)天，INS 濃度開始顯著下降［（0.27±0.02）ng∕mL］（表1）。產(chǎn)后14 d，INS 濃度為（0.34±0.01）ng∕mL，分娩當(dāng)天INS 濃度與RBP4 水平呈正相關(guān)（R=0.84）。

表1 奶牛血清中INS 濃度

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)首次證明了初乳中存在大量RBP4，但常乳中卻很少。初乳中RBP4 水平的增加伴隨著產(chǎn)犢當(dāng)天血漿RBP4 的相應(yīng)降低。由于RBP4 在常乳中幾乎不存在，因此RBP4 不太可能在乳腺中合成。RBP4 最有可能從血液轉(zhuǎn)移到初乳，導(dǎo)致血漿水平降低。在乳清中，乳球蛋白是視黃醇的載體，由于一分子RBP4 與一分子視黃醇結(jié)合［9］，初乳中視黃醇的存在比RBP4 濃度高近20 倍，表明乳球蛋白是初乳和牛奶中的主要視黃醇載體。尚不清楚初乳RBP4 作為視黃醇載體的生理相關(guān)性，但如嚙齒動(dòng)物中所述，RBP4 作為代謝調(diào)節(jié)劑有助于小牛發(fā)育是合理的［5］。

Nonnecke 等［10］研究顯示，用不同量的維生素A飼喂?fàn)倥?，血漿視黃醇和RBP4 水平呈正相關(guān)。機(jī)體循環(huán)中視黃醇與RBP4 之間的相似關(guān)系在兒童和嬰兒中證實(shí)了［11］，提示RBP4 是視黃醇的替代標(biāo)志物。在奶牛初乳中發(fā)現(xiàn)了大量的RBP4，同時(shí)血漿RBP4 下降，表明RBP4 是從血液轉(zhuǎn)運(yùn)到初乳的。RBP4 和視黃醇水平在生理和病理生理?xiàng)l件下是獨(dú)立調(diào)節(jié)的。

人類醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，RBP4 與多種代謝疾病的產(chǎn)生有密切關(guān)系，如常見的肥胖癥、糖尿病等，人體和嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)的RBP4 主要通過激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)來抑制胰島素的抵抗［12］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ逯蠭NS 與RBP4 呈正相關(guān)，表明在奶牛產(chǎn)后體內(nèi)胰島素代謝與RBP4 密切相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步研究。