李卜宇，黃婷，陳曉麗，等.薄片青岡葉綠體全基因組的特征及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].南方農(nóng)業(yè)，2023，17（23）：1-7.

摘 要 櫟屬（Quercus）青岡亞屬（subgenus Cyclobalanopsi）的薄片青岡（Quercus lamellosa），是一種具有較高經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的高大喬木，可用于營(yíng)造用材林、園林美化、水土保持等。為有助于該物種的分子鑒定、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究，開展了葉綠體基因組測(cè)序分析。首次報(bào)道了薄片青岡葉綠體基因組全序列：整個(gè)葉綠體基因組長(zhǎng)度為160 928 bp，總GC含量為37.97%；由大的單拷貝（LSC，90 276 bp），小的單拷貝（SSC，18 902 bp）和一對(duì)反向重復(fù)（IRs，每個(gè)25 875 bp）組成。該基因組共預(yù)測(cè)到133個(gè)基因，其中包括8個(gè)核糖體RNA基因、38個(gè)轉(zhuǎn)移RNA基因和87個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。此外，發(fā)現(xiàn)薄片青岡葉綠體基因組中高頻密碼子的第三個(gè)堿基偏向A/U，且自然選擇對(duì)薄片青岡葉綠體基因組密碼子偏好性的影響較大。共檢測(cè)到113個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）和38個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，薄片青岡最先從青岡亞屬分支中分化出來(lái)，是青岡亞屬植物中較為原始的物種。

關(guān)鍵詞 櫟屬；薄片青岡；葉綠體基因組；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)：S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.23.001

收稿日期：2023-05-18

基金項(xiàng)目：華夏英才基金項(xiàng)目“米倉(cāng)山自然保護(hù)區(qū)臺(tái)灣水青岡種群更新機(jī)制研究”（463361）。

作者簡(jiǎn)介：李卜宇（1997—），女，重慶大足人，在讀碩士，主要從事木本植物系統(tǒng)發(fā)育研究。E-mail：576806057@qq.com。

*為通信作者，E-mail：zhangmei103127@sina.com。

櫟屬（Quercus）青岡亞屬（subgenus Cyclobalanopsi）植物廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶地區(qū)，目前已知90～120種[1]，因其木材硬度高、強(qiáng)度大、耐腐性好，在建筑、運(yùn)動(dòng)器材、造船等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。此外，其殼斗和樹皮中富含單寧，可用于制備栲膠，而種子則可以用于飼料、釀酒和工業(yè)淀粉的生產(chǎn)[2]。薄片青岡（Quercus lamellosa）正式發(fā)表于1821年，由詹姆斯·愛德華·史密斯（James Edward Smith）在書中記錄其果實(shí)具有多層重疊鱗片7～10個(gè)同心環(huán)，因殼斗苞環(huán)張開，而易同本亞屬的其他種類相區(qū)別[3-4]。薄片青岡為常綠高大喬木，高可達(dá)40 m以上，我國(guó)廣西、云南和西藏等地均有分布，生于海拔1 300～2 500 m雜木林中[5]。目前，對(duì)薄片青岡的分類研究目前主要集中于形態(tài)學(xué)和核基因方面，而對(duì)其分類地位和種間關(guān)系尚不明確[6]。

葉綠體（cp）是一種專門用于能量轉(zhuǎn)換的獨(dú)特細(xì)胞器，在藻類和高等植物中具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)。植物cp含有獨(dú)立的cp基因組DNA，主要是母體孤雌生殖[7-8]。cp基因組序列通常被用于物種分類、遺傳進(jìn)化和種群變異的DNA條形碼。因此，相較于傳統(tǒng)分類學(xué)研究方法，cp基因組可以提供更多穩(wěn)定的遺傳信息用于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和種內(nèi)多樣性的研究[9]。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，cp基因組越來(lái)越多地被用于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建，自從2014年第一個(gè)櫟屬植物北方紅櫟（Quercus rubra）的cp基因組被公布以來(lái)，迄今有30種櫟屬植物的cp基因組已完成測(cè)序[10-12]。

本研究采用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)薄片青岡的cp基因組進(jìn)行測(cè)序，組裝獲得第一份薄片青岡cp基因組序列。通過(guò)注釋對(duì)其結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行界定與分析，以及系統(tǒng)發(fā)育研究，旨在為青岡亞屬植物的分子標(biāo)記開發(fā)和系統(tǒng)發(fā)育研究提供一定參考。

1" 材料與方法

1.1" 植物材料和DNA測(cè)序

本研究材料采自于昆明植物園（云南省昆明市盤龍區(qū)藍(lán)黑路132號(hào)），將采集到的薄片青岡新鮮葉片置于硅膠中干燥保存。將其提交給上海派森諾生物科技有限公司，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序。TruSeqDNA樣品制備試劑盒（Illumina，SanDiego，CA，USA）用于構(gòu)建Illumina雙末端文庫(kù)。配對(duì)末端（2×150 bp）測(cè)序在Illumina NovaSeq平臺(tái)上進(jìn)行，產(chǎn)生約8.6 GB的原始讀序（Rawreads）。對(duì)公司返回原始讀序的使用fastq[13]去除質(zhì)量低的read后獲得純凈讀序（cleandata）用于后續(xù)分析。

1.2" 方法

1.2.1" cp基因組組裝和注釋

使用getOrganelle[14]組裝其過(guò)濾后的序列，以北美紅橡（Quercus rubra，序列號(hào)JX970937）作為參考序列；再使用cpGAVAS2[15]對(duì)組裝的cp基因組進(jìn)行注釋；最后使用geneious prime 2022[16]對(duì)注釋后的cp基因組進(jìn)行手動(dòng)校正，包括起始密碼子和終止密碼子的位置，以及內(nèi)含子和外顯子的邊界，通過(guò)序列與相關(guān)物種的比較，確保注釋結(jié)果的準(zhǔn)確性。最終得到的結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：ON497016）。隨后將注釋文件上傳至在線網(wǎng)站OGDRAW[15]（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）得到薄片青岡cp全基因組完整圖譜（見圖1）。

1.2.2" 重復(fù)序列和SSR

使用在線軟件REPuter[17]（https：bibiserv.cebitec.uni-bielefeld）對(duì)薄片青岡cp基因組采用四種重復(fù)方式進(jìn)行搜索：包括正向重復(fù)序列（F）、反向重復(fù)序列（R）、回文重復(fù)序列（P）及互補(bǔ)重復(fù)序列（C）。參數(shù)設(shè)置為1 000，最小重復(fù)長(zhǎng)度設(shè)置為30，漢明距離設(shè)置為3（表示一對(duì)重復(fù)序列的相似度不能小于90%），其余參數(shù)均為默認(rèn)。SSR為特殊的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，通過(guò)在線軟件MISA[18]（https：webblast.ipkgatersleben.de/misa/）分析。其參數(shù)設(shè)置如下：?jiǎn)魏塑账?、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最小重?fù)數(shù)分別為10、5、4、3、3和3。以上分析的所有重復(fù)都經(jīng)過(guò)人工驗(yàn)證，并且刪除了多余的結(jié)果。

1.2.3" 密碼子的使用

使用geneious prime 2022[16]提取編碼基因（codingsequence，CDS）并篩選，得到52條大于300 bp且不重復(fù)，并且滿足起始密碼子為ATG的編碼基因進(jìn)行后續(xù)分析。使用CodonW 1.4.2程序?qū)Ρ∑鄬鵦p基因組中52條CDS序列的氨基酸使用頻率、有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codon，ENC），以及密碼子相對(duì)使用頻率（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和偏好性分析。

1.2.4" 薄片青岡與其近緣物種系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定薄片青岡在櫟屬植物中的進(jìn)化地位，以三棱櫟（Trigonobalanus doichangensis）外類群，篩選中國(guó)櫟屬物種和薄片青岡共計(jì)21種的cp全基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。使用MAFFT軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用MEGA11.0[19]進(jìn)行手工校正后采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和鄰接法（neighbor-joining Method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)置為1 000，以此推斷各節(jié)點(diǎn)的支持率。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 基因組的特征

薄片青岡完整cp核苷酸序列范圍為160 928 bp，具有在大多數(shù)陸地植物中發(fā)現(xiàn)的典型四分體結(jié)構(gòu)。包括一個(gè)90 276 bp的LSC區(qū)域和一個(gè)18 902 bp的SSC區(qū)域，由一對(duì)25 875 bp的IR區(qū)域隔開。全基因組、LSC、SSC和IR中的GC含量分別為37.83%、34.82%、31.07%和42.71%；被子植物中常見的現(xiàn)象是IR區(qū)的GC含量明顯高于LSC和SSC區(qū)，這是因?yàn)樵搮^(qū)域存在rRNA基因[20]。薄片青岡共有133個(gè)基因，包括編碼基因87個(gè)、tRNA基因38個(gè)、rRNA基因8個(gè)；這些基因根據(jù)其不同的功能分為三組。在這些基因中，15個(gè)基因含有一個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)基因（ycf3、clpP、rps12）有兩個(gè)內(nèi)含子。trnK-UUU基因的內(nèi)含子最長(zhǎng)（2 506 bp），而matK基因位于其內(nèi)含子中。rps12基因是反式剪接基因，其5′端和重復(fù)的3′端分別位于LSC和IR區(qū)域（見圖1、表1）。

2.2" 重復(fù)序列和SSR

薄片青岡cp基因組中共檢測(cè)到38個(gè)散在重復(fù)序列，包括15個(gè)正向重復(fù)序列（F）、22個(gè)回文重復(fù)序列（P）和1個(gè)反向重復(fù)序列（R），而未發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)重復(fù)序列（C）。其中，21個(gè)重復(fù)為30～35 bp，10個(gè)重復(fù)為36～40 bp，6個(gè)重復(fù)為41～60 bp，1個(gè)重復(fù)超過(guò)60 bp（為最長(zhǎng)重復(fù)，達(dá)25 875 bp）。這些重復(fù)序列中的大多數(shù)位于內(nèi)含子和基因間隔區(qū)（IGS）中，少數(shù)位于外顯子中。此外，從重復(fù)片段大小來(lái)看，可以發(fā)現(xiàn)大部分序列長(zhǎng)度集中在30～40 bp范圍內(nèi)，尤其是30～35 bp（見圖2）。

薄片青岡cp基因組中共檢測(cè)到113個(gè)SSR，包含單堿基79個(gè)、二堿基15個(gè)、三堿基6個(gè)、四堿基9個(gè)、五堿基3個(gè)和六堿基1個(gè)。單堿基重復(fù)類型絕大部分表現(xiàn)為A/T，僅存在9個(gè)C/G單堿基SSR（見表2）。從基因的四分體結(jié)構(gòu)分析，SSR有85個(gè)位于LSC， 16個(gè)位于SSC，12個(gè)位于IR。而從基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的角度來(lái)看，79個(gè)位于基因間隔區(qū)，18個(gè)位于內(nèi)含子，16個(gè)位于外顯子。

2.3" 蛋白質(zhì)編碼基因中的密碼子使用

薄片青岡cp基因組的蛋白質(zhì)編碼序列中，UAA終止密碼子占總終止密碼子（UAA、UAG和UGA）的近50%。這一結(jié)果表明，薄片青岡的cp基因組對(duì)終止密碼子UAA的編碼具有特殊的偏好。RSCU值大于1的密碼子有32種，包括GCA（Ala）、UGU（Cys）、GAU（Asp）、GAA（Glu）UUU（Phe）和GGA（Gly）等（見圖3）。上述32個(gè)密碼子中共有28個(gè)以A/U堿基結(jié)尾，說(shuō)明高頻密碼子的第三個(gè)堿基偏向A/U。

密碼子第一個(gè)位置的平均GC含量為46.14%，第二個(gè)位置為37.82%，第三個(gè)位置為29.96%，所有密碼子為37.97%（見圖4）。由ENC-GC3關(guān)聯(lián)分析可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線下方匯集了大部分基因，這一結(jié)果說(shuō)明自然選擇對(duì)薄片青岡cp基因組密碼子偏好性的影響較大（見圖5）。

2.4" 系統(tǒng)發(fā)育推斷

20個(gè)櫟屬植物和1個(gè)外類群的完整的cp基因組被用來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用最大似然法（ML）和鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，且獲得強(qiáng)支持率（見圖6）。外類群三棱櫟最先從發(fā)育樹分化出來(lái)，其余20個(gè)櫟屬植物聚成兩大支：青岡亞屬和櫟亞屬。值得注意的是，薄片青岡最先從青岡亞屬支分化出來(lái)，且未與其他青岡亞屬物種聚為姐妹支，此結(jié)果與鄧敏[6]使用RAD-seq（限制性位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序）重建青岡亞屬的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致。

3" 結(jié)論與討論

3.1" 結(jié)論

本研究對(duì)薄片青岡的cp基因組進(jìn)行了全面的結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)研究，獲得了該物種的完整cp基因組序列，并對(duì)其進(jìn)行了注釋。發(fā)現(xiàn)薄片青岡的cp基因組大小為160 928 bp，符合一般被子植物cp基因組范圍，通過(guò)對(duì)cp基因組特征進(jìn)行分析，研究結(jié)果表明薄片青岡植物的cp基因組在基因組結(jié)構(gòu)、基因組成、基因順序和GC含量等方面均是高度保守的。薄片青岡的cp基因組基本特征與其他青岡亞屬植物相似，基因組特征分析為青岡亞屬植物cp基因組提供了更多的認(rèn)識(shí)，也為青岡亞屬的cp基因組分化提供了一定的支持。

3.2" 討論

不同生物使用密碼子的偏好差異性很大，GC含量是造成密碼子使用偏好的主要因素，且在基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)化歷程中扮演重要角色，它會(huì)影響熱穩(wěn)定性，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程[21]。有研究表明，密碼子不同位置的GC含量有差異，而相對(duì)同義密碼子使用（RSCU）可以代表使用同義密碼子的相對(duì)概率，反映不同密碼子的使用偏差[22]。通過(guò)GC含量和RSCU分析，薄片青岡cp基因組的A/U堿基含量高，且在密碼子第三位出現(xiàn)堿基A/U概率更大，這點(diǎn)與同為殼斗科的蒙古櫟（Quercus mongolica）和槲櫟（Quercus aliena）等植物cp基因組密碼子使用偏好性一致[23]。SSRs被廣泛用于物種鑒定、種群遺傳和系統(tǒng)發(fā)育分析中的遺傳標(biāo)記[24]，薄片青岡鑒定出113個(gè)SSR，其中單核苷酸重復(fù)（A/T）占SSR數(shù)量的69.91%。本研究中搜索薄片青岡長(zhǎng)序列重復(fù)序列（長(zhǎng)度大于30 bp），檢測(cè)到包括15個(gè)正向、22個(gè)回文和1個(gè)反向重復(fù)序列，而未發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)重復(fù)序列；38對(duì)長(zhǎng)重復(fù)序列，其中回文重復(fù)序列最為豐富。4個(gè)重復(fù)序列主要集中在IR和LSC區(qū)域，只有少數(shù)存在于SSC區(qū)域。這些類型的SSR和長(zhǎng)重復(fù)序列可作為研究薄片青岡及其近緣物種的遺傳變異的分子標(biāo)記。這與殼斗科的檀子櫟（Quercus baronii）和匙葉櫟（Quercus dolicholepis）等植物cp基因組的重復(fù)序列分析一致[21]。

基于櫟屬植物形態(tài)的分類學(xué)研究，由于物種間的趨同進(jìn)化和頻繁的雜交而受到限制。而絕大多數(shù)使用cp基因組的研究都獲得了高分辨率和高支持度的系統(tǒng)發(fā)育樹，即使是在那些具有系統(tǒng)發(fā)育挑戰(zhàn)性的植物類群中[25-28]。結(jié)合其他學(xué)者系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析，薄片青岡位于青岡亞屬支的基部，推測(cè)可能是櫟亞屬和青岡亞屬的過(guò)渡物種，但我們還需要更多額外的數(shù)據(jù)來(lái)確定薄片青岡與相近類群準(zhǔn)確關(guān)系的問(wèn)題。理想情況下，櫟屬植物的物種劃分問(wèn)題可以用基因組信息解決。然而，目前研究表明cp基因組只是植物基因的一部分，我們期待著努力尋找一個(gè)，更確切地說(shuō)是一套用于系統(tǒng)發(fā)育或種群推論基因方法來(lái)破解櫟屬植物進(jìn)化的奧秘。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）