賀宇文 湯冠宇 李楚楚 李燦 紀(jì)春曉 陳韜

摘 要：血管生成素4（ANG4）是一種新型抗菌肽蛋白，具有抗菌、抗炎、血管生成、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能，在機(jī)體先天免疫過程中發(fā)揮重要的作用。ANG4在新生小鼠腸道的表達(dá)受到多種因素的調(diào)節(jié)，如細(xì)菌信號(hào)和發(fā)育過程等。本試驗(yàn)選取細(xì)菌細(xì)胞壁表面分子的類似物殼寡糖（COS）作為誘導(dǎo)物，探究其對(duì)小鼠腸道ANG4表達(dá)和對(duì)腸道形態(tài)的影響。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）分析表明，COS能增加小鼠腸道ANG4 mRNA及ANG4蛋白的表達(dá)；形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，COS使小腸絨毛高度明顯增加，平均隱窩深度均有降低，V/C值增加，表明COS可通過誘導(dǎo)ANG4等抗菌蛋白的表達(dá)，或通過其殺菌和免疫調(diào)節(jié)作用而不同程度地提高小腸黏膜的完整性。研究結(jié)果為COS以及ANG4在仔豬腸道疾病防治的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：ANG4；COS；抗菌蛋白；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；蛋白質(zhì)免疫印跡

中圖分類號(hào)：Q78 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.006

Inducing Effects of COS on Expression of Antimicrobial Protein ANG4 in Intestine

HE Yuwen2， TANG Guanyu1， 3， LI Chuchu1， LI Can1， JI Chunxiao1， CHEN Tao1， 3*

（1. College of Veterinary Medicine， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 2. Hunan Provincial Institution of Veterinary Drug and Feed Control， Changsha 410006， China; 3. Hunan Veterinary Drug Engineering and Technology Research Center， Changsha 410128， China）

Abstract： Angiogenin 4 （ANG4）， ?a novel antimicrobial protein with multiple biological functions， such as antimicrobial， anti-inflammation， angiogenesis and regulating the bodys immune response， plays a key role in innate immunity. The expression of ANG4 in neonatal mice intestine is regulated by some factors including microbial signal and developmental stage. ?Being an analogue of surface molecules of bacterial cell wall， chitosan oligosaccharide （COS） was selected as a inducer to explore the effects on ANG4 expression and mophology in post weaning mice intestine. qRT-PCR and Western blot analyses showed that the mRNA ?and protein levels of ANG4 increased suggesting that COS can upregulate the expression of ANG4. The results of HE staining of mouse intestinal tract showed that the height of intestinal villi， the depth of crypt and the value of V/C increased significantly. It indicates that COS can improve the integrity of intestinal mucosae in some extent through either inducing the expression of some intestinal antimicrobial proteins， such as ANG4， or its antimicrobial and immunomodulation activities， and provide the theoretical basis for the applications of COS and ANG4 in controlling the intestinal diseases in piglets.

Key words： ANG4; COS; AMPs; qRT-PCR; Western blot

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 234-239）

血管生成素（angiogenin，ANG）在上世紀(jì)70年代被Folkman等作為腫瘤的血管生成因子分離，可參與實(shí)體腫瘤的形成、發(fā)展和遷移過程中極為重要的步驟［1］。近年來許多研究表明，ANG不僅能促進(jìn)血管的生成，還能從多方面影響炎癥的發(fā)生以及腸道菌群的穩(wěn)態(tài)［2-3］。ANG與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）協(xié)同參與血管的形成以及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性。ANG4屬于血管生成素家族，小鼠ANG4成熟蛋白由144個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約16 kD［4］ ，是一種新型的抗菌蛋白，具有多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)血管生成［5］、促進(jìn)黑色瘤細(xì)胞的增殖［6］和抗炎作用等［7］。ANG4主要在腸道和胰腺中表達(dá)［8］，對(duì)腸道中的細(xì)菌具有選擇性毒性，如1 ?mol/L的ANG4處理2 h就能殺滅99%以上的致病菌糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和單增李斯特氏菌 （Listeria monocytogenes），而腸道共生菌大腸桿菌K12（Escherichia coli）可耐受高達(dá)10 ?mol/L的ANG4［9］。Hooper等［9］在小鼠小腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ANG4 mRNA，其主要在小腸的潘氏細(xì)胞中表達(dá)，且表達(dá)受到細(xì)菌信號(hào)的調(diào)節(jié)，尤其在小鼠斷奶后期表達(dá)量可升高30多倍，這意味著ANG4在小鼠斷奶后的免疫撤除和應(yīng)激中發(fā)揮了重要的作用。

殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）是氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖通過β-1， 4糖苷鍵連接而成的聚合度為2～20的功能性低聚糖［10］，在結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖（peptidoglycan，PG）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）相似。COS具有抗菌［11］、抗氧化［12］、免疫調(diào)節(jié)和抗炎［13-14］等功能，同時(shí)COS還具有相對(duì)分子質(zhì)量低、生物活性高、水溶性較好、無毒、易被動(dòng)物體吸收利用等優(yōu)點(diǎn)［10］。因此，COS作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用畜牧業(yè)生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明，COS作為PG的類似物能明顯上調(diào)小鼠腸道組織表達(dá)抗菌蛋白R(shí)egIIIγ［15］。本研究擬以COS為誘導(dǎo)物，觀察其對(duì)ANG4表達(dá)和腸道形態(tài)的影響，為斷奶仔豬腹瀉的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

此動(dòng)物試驗(yàn)的所有程序均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，動(dòng)物的使用經(jīng)過湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)（43321503）的批準(zhǔn)。本試驗(yàn)所用昆明小鼠（Mus musculus）購(gòu)于湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)：SCXK（湘）2015-0010０］。選擇12只懷孕母鼠（SPF級(jí)），飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院第三教學(xué)樓動(dòng)物房，正常采食與飲水。

1.1.2 主要試劑

小鼠ANG4多抗（上海強(qiáng)耀生物）；β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（谷歌生物公司）；Trizol（Takara生物技術(shù)有限公司）；10%中性福爾馬林固定液、0.9%生理鹽水、COS溶液配制、30%聚丙烯酰胺溶液、1×電泳緩沖液、1×轉(zhuǎn)膜緩沖液、10×TBS、TBST、封閉液等均由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣

將12只孕鼠分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物飼養(yǎng)房中，平均溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，正常采食與光照。母鼠產(chǎn)仔后新生小鼠用于試驗(yàn)。COS處理參照孟江海等［15］，選定3個(gè)劑量組（200、600、1 000 mg/kg）。隨機(jī)選取80只17日齡的小鼠（雌雄各半）用于試驗(yàn)，每組各20只小鼠。試驗(yàn)開始后，試驗(yàn)組開始連續(xù)灌胃COS溶液，對(duì)照組灌胃同樣體積的生理鹽水；各組分別于19、21、23、25 d取5只小鼠處死，取小鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸組織分別儲(chǔ)存，用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）和組織切片分析。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)小鼠腸道ANG4 mRNA的表達(dá)

小鼠腸道總RNA提取與qRT-PCR方法參照向瓊昊等［16］所用方法，委托上海啟因生物公司完成。qRT-PCR反應(yīng)完成后，采用ΔΔCT法計(jì)算檢測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western-blot檢測(cè)小鼠腸道ANG4蛋白的表達(dá)

腸道組織蛋白提取、定量及Western blot分析方法參照林夢(mèng)雨等［17］所用方法，并用Image-Lab軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 組織切片觀察小鼠腸道組織變化

將小鼠腸道組織取出，用生理鹽水沖洗后放入中性福爾馬林固定液中固定后用于蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining， HE）［15］，將切片置于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)分析與作圖均使用GraphPad Prism軟件，并用t檢驗(yàn)等方法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，P>0.05則統(tǒng)計(jì)無顯著差異；P<0.05則統(tǒng)計(jì)為差異顯著，標(biāo)記為*；P<0.01則統(tǒng)計(jì)為差異極顯著，標(biāo)記為**。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量COS誘導(dǎo)對(duì)小鼠腸道ANG4 mRNA表達(dá)的影響

通過qRT-PCR分析（圖1），不同劑量的COS對(duì)ANG4 mRNA表達(dá)的影響是不同的：其中200 mg/kg組無論是在4個(gè)不同的部位，還是不同的時(shí)間點(diǎn)，ANG4的表達(dá)均無明顯變化，在空腸甚至還有降低；而600和1 000 mg/kg組中ANG4 mRNA的表達(dá)均有顯著上調(diào)，但劑量效應(yīng)并不明顯；同時(shí)在十二指腸、空腸和回腸中還表現(xiàn)出隨發(fā)育階段表達(dá)水平逐漸升高的趨勢(shì)，但差異不明顯，而這種變化趨勢(shì)在結(jié)腸中并不明顯。比較小腸不同部位ANG4 mRNA的表達(dá)水平，可以發(fā)現(xiàn)，600和1 000 mg/kg 2個(gè)劑量組中，十二指腸、空腸和回腸的整體表達(dá)水平要高于結(jié)腸。

2.2 不同劑量COS誘導(dǎo)對(duì)小鼠腸道ANG4蛋白

表達(dá)的影響

COS對(duì)小鼠腸道ANG4蛋白表達(dá)水平的影響見圖2。和對(duì)照組相比，在200 mg/kg劑量組的十二指腸、空腸和回腸中ANG4表達(dá)水平無明顯變化，不過在25 d稍有升高（P<0.05）；而600和1 000 mg/kg 2個(gè)組則從21 d 開始就有明顯上調(diào)（P<0.05），且呈現(xiàn)出隨發(fā)育時(shí)間而升高的趨勢(shì)，但2個(gè)劑量組的蛋白表達(dá)量與COS劑量無明顯相關(guān)性；和小腸相比，結(jié)腸中的ANG4表達(dá)水平相對(duì)較低，和小腸相同的是200 mg/kg COS處理對(duì)ANG4的表達(dá)幾乎沒有影響，而600和1 000 mg/kg COS處理增加了ANG4的表達(dá)，這一結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果相符。

2.3 不同劑量COS對(duì)小鼠腸道形態(tài)的影響

本試驗(yàn)通過HE染色來觀察小鼠腸道不同節(jié)段的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度以及其形態(tài)變化，結(jié)果如圖3所示。所有劑量組與對(duì)照組相比，腸黏膜的整體結(jié)構(gòu)無明顯差異，但4個(gè)腸段的腸絨毛排列更加緊密。

從圖4可以看出，不同劑量的COS處理對(duì)于小腸的絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度、絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比值（villus length/crypt depth，V/C）均有一定的影響。相對(duì)來說，200 mg/kg劑量組的影響最小，在十二指腸中以600 mg/kg劑量組更加明顯，腸絨毛的高度增加，十二指腸隱窩深度有所下降，V/C值整體升高，除23和25 d的隱窩深度差異顯著（P<0.05）外，其他均沒有顯著性差異（P>0.05）。而在空腸和回腸中1 000 mg/kg劑量的影響更加明顯。比較小腸的3個(gè)節(jié)段，COS處理對(duì)回腸形態(tài)的影響最大，1 000mg/kg劑量的隱窩深度和V/C值均出現(xiàn)了明顯的變化（P<0.05）。

3 討論

仔豬在斷奶期由于免疫撤除、母源抗體的缺失、飼料的改變、換欄等多種原因造成的應(yīng)激，使其抵抗外來微生物的能力減弱，很容易引起斷奶期仔豬的腹瀉，而腹瀉又是造成斷奶仔豬死亡的重要原因。作為一種新型的抗菌蛋白，ANG4的表達(dá)在受到斷奶刺激或者外來病原微生物的刺激后會(huì)增多，這意味著ANG4在斷奶期的先天免疫過程中發(fā)揮了重要的作用。本試驗(yàn)以小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，利用不同劑量的COS作為誘導(dǎo)物來灌胃小鼠，觀察其對(duì)腸道抗菌蛋白ANG4的表達(dá)以及腸道形態(tài)的影響，為ANG4在斷奶仔豬腹瀉防治中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

ANG4在小鼠腸道中的表達(dá)受到發(fā)育和細(xì)菌信號(hào)的雙重調(diào)控［18］，在新生小鼠的腸道中幾乎不表達(dá)，到斷奶時(shí)其表達(dá)水平可提高約30倍，在這一階段，無菌和常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠ANG4的表達(dá)水平接近，但隨后其表達(dá)水平出現(xiàn)了明顯的差異，常規(guī)飼養(yǎng)小鼠ANG4的表達(dá)水平明顯高于無菌小鼠，表明在這一階段細(xì)菌信號(hào)可誘導(dǎo)ANG4的表達(dá)［9］。細(xì)菌可通過其細(xì)胞壁的表面分子如PG或LPS作為配體，與模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）即TLRs（toll like receptors）結(jié)合，激活相應(yīng)的信號(hào)途徑誘導(dǎo)多種抗菌蛋白的產(chǎn)生［19］。本項(xiàng)目組前期報(bào)道了采用滅活金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，G+）及其表面分子PG［20］、滅活大腸桿菌（Escherichia coli，G-）及其表面分子LPS［21］來處理豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2細(xì)胞，均能誘導(dǎo)抗菌蛋白R(shí)egIIIγ的表達(dá)。COS是一種結(jié)構(gòu)上與PG和LPS類似的化合物，具有抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，作為飼料添加劑廣泛地應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。孟江海等［15］給斷奶期間的小鼠連續(xù)灌胃COS，發(fā)現(xiàn)能提高小腸中RegIIIγ的表達(dá)。本試驗(yàn)共選取200、600和1 000 mg/kg 3個(gè)COS劑量，對(duì)斷奶后的小鼠進(jìn)行連續(xù)COS灌胃，并在mRNA和蛋白質(zhì)水平來檢測(cè)ANG4的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)除200 mg/kg處理無明顯影響外，600和1 000 mg/kg處理均可增加ANG4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，表達(dá)水平呈現(xiàn)出隨發(fā)育而逐漸升高的趨勢(shì)，但無明顯劑量效應(yīng)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，ANG4在小腸的表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸，這一結(jié)果與Hooper等［9］的報(bào)道相符。而向瓊昊等［16］報(bào)道了新生仔豬小腸和結(jié)腸的ANG4的表達(dá)特征，結(jié)果顯示，小腸和結(jié)腸均能產(chǎn)生ANG4，且表達(dá)水平比較接近，這與本研究結(jié)果有差別，造成這一差別的原因可能與小鼠和豬分屬不同物種有關(guān)。

小腸是動(dòng)物消化吸收的主要器官，其形態(tài)變化可影響機(jī)體的消化和吸收，同時(shí)小腸黏膜分泌的多種抗菌蛋白可以抵御外來微生物的入侵，預(yù)防腸道疾病的發(fā)生。小腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度、V/C值是衡量小腸形態(tài)的重要指標(biāo)。小腸絨毛越長(zhǎng)，小腸吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的面積就越大［22］。在腸絨毛中只有成熟的絨毛上皮細(xì)胞才具有吸收營(yíng)養(yǎng)的功能，所以，絨毛高度與細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)。同時(shí)在小腸不同節(jié)段中，回腸是吸收的主要部位，其形態(tài)的變化對(duì)于吸收功能具有直接的影響。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，COS處理對(duì)小鼠小腸不同節(jié)段整體結(jié)構(gòu)無明顯影響，但對(duì)絨毛高度、隱窩深度和V/C值有一定的影響。十二指腸的絨毛的高度略有增加，隱窩深度有所下降，V/C值整體升高，3個(gè)劑量中以600 mg/kg對(duì)其形態(tài)的影響更明顯一些；和十二指腸相比，COS處理對(duì)小鼠的空腸和回腸的影響更加明顯，尤其是回腸，1 000 mg/kg處理組中3個(gè)指標(biāo)均出現(xiàn)了顯著的變化（P<0.05），可能與其是小腸中絨毛最豐富的部分有關(guān)。在這些指標(biāo)的變化中，絨毛高度的增加一方面可能是由于COS的處理能誘導(dǎo)抗菌蛋白R(shí)egIIIγ［15］和ANG4表達(dá)的升高，前者具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)功能，同時(shí)二者均具有抗炎的作用［18］，對(duì)于絨毛的完整性具有一定的促進(jìn)作用，另一方面也與COS本身具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)［11，13］。

綜上所述，COS可以誘導(dǎo)小鼠腸道ANG4的表達(dá)，同時(shí)對(duì)小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定的影響，有利于小腸的消化和吸收。鑒于以上研究結(jié)果，可以設(shè)想ANG4在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)中的畜禽腸道疾病，尤其是斷奶仔豬腹瀉防治中有著十分廣闊的應(yīng)用前景。

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