金珍杰 何平

氧化應(yīng)激是機(jī)體面對(duì)各種有害刺激時(shí)所作出的應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失去平衡，產(chǎn)生大量的氧化應(yīng)激產(chǎn)物在體內(nèi)大量蓄積。這些產(chǎn)物稱之為活性氧族（reactive oxygen species，ROS），ROS 主要包括超氧陰離子、過氧化物、羥自由基等。ROS 主要產(chǎn)生于還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶途徑及線粒體途徑，其中超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）可以清除體內(nèi)的氧自由基；血紅素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）是在腎小管細(xì)胞中合成的一種酶，是對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)最強(qiáng)烈的酶之一，具有保護(hù)、抗炎作用；8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）是比較敏感的氧化應(yīng)激損傷下DNA 損害的生物標(biāo)志物。在正常生理狀態(tài)下，人體內(nèi)存在較低水平的ROS，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，組織細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS 就會(huì)影響人體的重要物質(zhì)如核酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪以及其他分子的代謝，從而損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能，對(duì)機(jī)體造成損害[1-2]。

我國人群HBV 攜帶率較高[3]，HBV 相關(guān)性腎炎（hepatitis B virus associated glomerulonephritis，HBVGN）是HBV 引起的腎臟繼發(fā)性損傷[4]。乙肝患者中的HBV-GN 發(fā)生率達(dá)8%～20%[5]。目前HBV-GN 的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）血清HBV 抗原陽性；（2）患者有腎小球腎炎，并且能夠除外狼瘡性腎炎等其他一些繼發(fā)性的腎小球疾??；（3）腎組織病理切片中能夠找到HBV 抗原。其中（2）（3）為診斷的必要條件。目前，氧化應(yīng)激與HBV-GN 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系研究不多。本研究旨在探討氧化應(yīng)激指標(biāo)在HBV-GN 組織中的表達(dá)情況，分析氧化應(yīng)激指標(biāo)與HBV-GN 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以期為HBV-GN 的診療提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2010 至2019 年中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院收治的HBV-GN 患者18 例，為觀察組?；颊呔贐 超引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)，行組織學(xué)、免疫組化或免疫熒光及超微病理學(xué)檢查確診，且排除狼瘡性腎炎等其他繼發(fā)性腎小球腎炎疾病。觀察組患者男14 例，女4 例；年齡24～66（40.44±9.32）歲；留取患者腎組織石蠟切片為研究材料。另擇2011 至2019 年本院收治的因腎臟腫瘤或外傷行腎組織切除術(shù)患者25 例，排除其他腎臟疾病，為對(duì)照組。對(duì)照組患者男18 例，女7 例；年齡30～60（44.28±10.26）歲；留取切除的距病灶最遠(yuǎn)端的切緣腎組織標(biāo)本為研究材料。兩組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 患者腎功能指標(biāo)檢測 患者首次入院時(shí)檢測24 h 尿蛋白、腎小球?yàn)V過率、血清肌酐、尿素氮水平等腎功能指標(biāo)。其中24 h 尿蛋白為患者進(jìn)行腎臟穿刺活檢前3 次24 h 尿蛋白的平均水平，其余均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)下所采集的靜脈血液檢測值。

1.2.2 患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)水平免疫組化檢測

1.2.2.1 試劑和儀器 兔抗人SOD、HO-1、8-OHdG單克隆抗體均購自北京中杉金橋公司；DBA試劑盒、免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司?？乖迯?fù)液配制：檸檬酸鈉0.4 g 及檸檬酸三鈉3 g 加入1 000 ml PBS 液中。顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)E 800）；圖像采集軟件Nis-Elements F 3.0；圖像分析軟件Nis-Elements Br-3.0。

1.2.2.2 檢測方法 將腎組織石蠟切片于PBS 液中浸泡5 min，然后脫蠟至水，再于檸檬酸-檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中微波抗原修復(fù)7.5 min；室溫下自然冷卻；PBS沖洗5 min×2 次；加入過氧化氫，室溫下放置45 min；PBS 沖洗5 min×2 次；加入山羊血清封閉抗原，室溫下放置45 min，分別加入兔抗人SOD 單克隆抗體（1∶800）、兔抗人HO-1 單克隆抗體（1∶800）、兔抗人8-OHdG 單克隆抗體（1∶800）于切片；4 ℃冰箱放置12 h；室溫下復(fù)溫10 min；PBS 液沖洗5 min×2，加入二抗試劑1 放置20 min，PBS 沖洗5 min×2 次；加入二抗試劑2（辣根過氧化物酶標(biāo)記），放置20 min，PBS 沖洗5 min×2，DBA 顯色，蘇木素復(fù)染，流水返藍(lán)，脫水透明，樹膠封片；以PBS 取代一抗作為陰性對(duì)照。分別于200 倍及400 倍顯微鏡下觀察，并使用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察兩組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)鏡下所見；（2）比較兩組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)水平；（3）分析觀察組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)水平與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)鏡下所見 見圖1、2、3（插頁）。

圖1 兩組患者腎組織SOD 表達(dá)鏡下所見（A：觀察組；B：對(duì)照組；免疫組化染色，×400）

圖2 兩組患者腎組織HO-1 表達(dá)鏡下所見（A：觀察組；B：對(duì)照組；免疫組化染色，×400）

圖3 兩組患者腎組織8-OHdG 表達(dá)鏡下所見（A：觀察組；B：對(duì)照組；免疫組化染色，×400）

2.2 兩組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)水平比較 兩組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），觀察組腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 水平均明顯高于對(duì)照組，見表1。

表1 兩組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)水平比較

2.3 觀察組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)水平與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性 觀察組患者24 h 尿蛋白定量、腎小球?yàn)V過率、血清肌酐、尿素氮水平分別為（4.79±2.44）g、（95.51±23.39）ml·min-1·1.73 m-2、（86.32±28.10）μmmol/L、（5.94±1.76）mmol/L。相關(guān)性分析顯示，觀察組患者腎組織HO-1 表達(dá)水平與腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)（r=0.667，P＜0.05），其余指標(biāo)間均無相關(guān)性（均P＞0.05）。見表2。

表2 觀察組患者腎組織SOD、HO-1、8-OHdG 表達(dá)水平與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

本研究結(jié)果顯示，觀察組患者腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)HO-1、SOD、8-OHdG 表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。即氧化應(yīng)激與HBV-GN 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我國乙肝患者較多，HBV-GN 也較多，HBV-GN 患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，以腎病綜合征最常見[6]。一種臨床表現(xiàn)可能有很多種的病理類型，同樣，一種病理類型也可有多種臨床表現(xiàn)[7]。目前研究表明其發(fā)病機(jī)制可能包括一下4 種：（1）HBV 抗原和其抗體形成的免疫復(fù)合物沉積于腎臟，并且能夠激活補(bǔ)體從而造成免疫損傷；（2）HBV 直接感染腎臟細(xì)胞；（3）機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能發(fā)生異常；（4）遺傳和一些社會(huì)因素等。普遍認(rèn)為，病毒直接感染腎臟細(xì)胞是HBV-GN的主要發(fā)病機(jī)制，但其具體發(fā)病機(jī)制仍不明確[8]。目前，HBV-GN 治療方案尚未統(tǒng)一，臨床常用的藥物有干擾素、核苷類似物、激素、免疫抑制劑、鈣神經(jīng)蛋白抑制劑及中醫(yī)中藥治療等，HBV-GN 治療方案個(gè)體性非常強(qiáng)，且治療效果不確切。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與HBV-GN 發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，或可為其治療提供更多思路。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HBV-GN 患者腎組織HO-1 表達(dá)水平與腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)，隨著腎組織HO-1的表達(dá)增強(qiáng)，腎小球?yàn)V過率增高，提示HO-1 的表達(dá)升高有利于改善腎臟功能。HO-1 是一種抗氧化劑，是血紅素降解的限速酶之一，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的多種細(xì)胞中，它可以可促進(jìn)血紅素產(chǎn)生膽綠素、CO、游離鐵等[9]，產(chǎn)生的這些物質(zhì)具有一定的抗氧化、抗炎等作用。在細(xì)胞水平上，HO-1 還可以調(diào)控含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的表達(dá)及凋亡標(biāo)志物p38 信號(hào)傳導(dǎo)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腎間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型試驗(yàn)中，隨著HO-1 的表達(dá)升高，能夠引起單核細(xì)胞趨化蛋白-1 及轉(zhuǎn)化生長因子β1 表達(dá)降低，而TGF-β1 在腎間質(zhì)纖維化形成過程中起重要的作用，而且它還可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生，從而對(duì)腎臟造成損害[11]。Correa-Costa 等[12]發(fā)現(xiàn)HO-1 的高表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化；而腎臟出現(xiàn)間質(zhì)纖維化會(huì)損傷腎臟功能，從而出現(xiàn)腎小球?yàn)V過率的下降。由此可知HO-1 可以通過降低TGF-β1 的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的異常過度增生，抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展[13]。由此可見，HO-1 通過降低腎間質(zhì)纖維化維持腎臟功能，目前關(guān)于H0-1 與腎臟疾病的研究較多，且有的已應(yīng)用于臨床。

目前一些抗氧化劑對(duì)一些其他類型的腎臟疾病的治療有大量研究。如Subramanian 等[14]研究橙皮苷（一種生物類黃酮）可以清除自由基，抑制炎癥反應(yīng)，上調(diào)通過轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)元件來上調(diào)HO-1，促進(jìn)抗氧化系統(tǒng)來抑制慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠腎臟毒性。Abdullah 等[15]研究表明磷酸肌酸的體內(nèi)外腎臟保護(hù)作用依賴于通過蛋白調(diào)節(jié)激酶介導(dǎo)的Nrf-2/HO-1 通路抑制細(xì)胞凋亡和ROS 生成，提示磷酸肌酸可能成為糖尿病腎病治療的一種新的治療候選。治療腎臟疾病的常用藥物雷公藤的有效成分雷公藤甲素對(duì)于Nrf-2/HO-1 通路也有一定的激活作用，目前其對(duì)于心臟方面的治療已有研究[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)普羅布考、硫辛酸可減輕氧化應(yīng)激，從而改善腎臟足細(xì)胞損傷[17]，前列地爾、α-酮酸等對(duì)于氧化應(yīng)激也有一定的作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、HO-1、8-OHdG 在HBV-GN 患者腎組織中表達(dá)增強(qiáng)，與疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。且HBV-GN 患者腎組織HO-1 表達(dá)水平與腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)。