陳艷春 徐世影 應航宇 陳志凌

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是人體接觸過敏原，體內免疫系統(tǒng)異常激活，并出現(xiàn)鼻癢、噴嚏和流涕等臨床癥狀的非感染過敏性疾病。AR 的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。目前研究認為，人體的微生物具有免疫調節(jié)作用，對包括AR 在內的過敏性疾病的發(fā)生起著積極的抑制作用，而過度使用抗生素可引起人體微生物改變，與AR患病風險增加有關[2-4]。通過調節(jié)免疫功能等方法治療來改善患者AR癥狀目前受到臨床好評[5]。防風為傘形科植物防風未抽花莖植株的干燥根部，用藥歷史悠久，具有增強免疫系統(tǒng)功能、抗炎和抗過敏作用[6]。因此，本研究通過雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）激發(fā)小鼠發(fā)生AR建立動物模型，觀察進一步使用抗生素對小鼠AR癥狀的影響以及防風水提物改善小鼠AR癥狀的作用，并探討這一作用的免疫機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40 只健康雄性Balb/c 小鼠[6 周齡，（20±2）g]購于上海靈暢生物科技有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003]，飼養(yǎng)于浙江鷹旸生物科技有限公司動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（浙）2021-0033]，飼養(yǎng)于（22±2）℃、50% ～60%濕度的通風環(huán)境，保證每日充足光照14 h，正常飲食。

1.1.2 實驗試劑 OVA 購于美國Sigma 公司（批號：SLCH2414）；IL-2、轉 化 生 長 因 子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA 試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號：A00922、A91123），IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ ELISA 試劑盒均購于江蘇酶免實業(yè)有限公司（批號：202105、202105、202106、202107、202108、202109、202109）；甲苯胺藍染液購于中國Servicebio 公司（批號：20220228）；BCA 蛋白定量試劑盒購于中國Solarbio 公司（批號：20220228）；Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）、TNF 受體關聯(lián)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）、核因子-κB p65（nuclear factor κB p65，NFκB p65）、NF-κB 抑制劑（inhibitor of NF-κB，IκBα）、活化IκBα（pho-IκBα，p-IκBα）、肌動蛋白（β-actin）購于美國Affinity抗體公司（批號：16c5074、27e2981、32a4053、12l8356、13s5835、12e1054）。CD4-FITC、CD25-PECy7、核轉錄因子Foxp3-BV421 流式抗體購自美國BD公司（批號：553055、335807、562996）。

1.1.3 實驗儀器 電泳儀、電泳槽、轉膜儀購自中國天能公司；化學發(fā)光儀購自中國勤翔公司；高速離心機購自美國Thermo 公司；酶標儀購自美國MD 公司；正置光學顯微鏡購自日本尼康公司；病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；C6流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠模型制備和分組 將OVA 與0.4%質量濃度的氫氧化鋁凝膠混合，配制0.2 mg/ml 濃度的OVA 致敏液；另用0.9%氯化鈉溶液稀釋OVA 制備滴鼻液（25 mg/ml）。參照文獻[7]方法激發(fā)小鼠AR：隨機選取32 只小鼠在實驗第1 天通過兩后足跖（0.1 ml）、兩腹股溝（0.1 ml）、背部兩處（0.1 ml）和腹腔（0.2 ml）注射OVA 致敏液，在第7、14、21 天，繼續(xù)通過腹腔注射0.5 ml OVA 致敏液。第22～35 天，用20 μl 滴鼻液刺激小鼠鼻腔，1 次/1 d。隨后，將小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、抗生素組、防風水提物組、防風水提物+抗生素組，另將未經(jīng)OVA 誘導的小鼠歸入正常組，每組8只，給與相應干預。

1.2.2 藥物制備及給藥 500 g防風生藥飲片由杭州市中醫(yī)院藥房提供。蒸餾水沖洗2次后再加2 000 ml煮沸2～3 h，過濾殘渣，留取濾液，60 ℃旋轉蒸發(fā)儀濃縮，凍干后最終得到25 g 防風濃縮固體。將防風濃縮固體溶于0.9%氯化鈉溶液配制成5 mg/ml防風水提液。用0.9%氯化鈉溶液配制質量濃度為210 mg/ml 的抗生素混合液（其中頭孢羥氨芐30 mg/ml，土霉素90 mg/ml，紅霉素90 mg/ml）?？股亟M、防風水提物組分別取防風水提液或抗生素混合液，稀釋1 倍后，每只小鼠給予0.2 ml 灌胃，1 次/d，持續(xù)2 周。防風水提物+抗生素組小鼠給予0.1 ml的防風水提液（無需稀釋）和0.1 ml的抗生素混合液（無需稀釋）灌胃，1次/d，持續(xù)2周。模型組和正常組小鼠均給予0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1 次/d，持續(xù)2周。實驗期間所有小鼠給予正常飲食。

1.2.3 小鼠AR 癥狀觀察 最后一次給藥0.5 h 后，將小鼠單獨置于籠中，OVA 滴鼻液刺激小鼠，觀察15 min內小鼠的打噴嚏和撓鼻次數(shù)，評價AR 癥狀。觀察結束后用二氧化碳窒息處死小鼠，心臟取血離心獲取血標本，兩側鼻腔用200 μl 無菌Hanks 平衡鹽溶液灌洗并收集鼻腔灌洗液。剪開小鼠鼻腔，收集小鼠鼻中隔黏附的完整鼻黏膜組織。取出小鼠脾臟，去除表面脂肪組織，無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小鼠血清中致敏因子（免疫球蛋白E、組胺、白三烯）、炎癥細胞因子和鼻腔灌洗液中炎癥細胞因子水平檢測 采用ELISA 法。按照ELISA 試劑盒內的操作說明檢測血清IgE、組胺、白三烯、IL-4、IL-5、TNFα、IL-2、IL-10、IFN-γ 以及鼻腔灌洗液中IL-6、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β1 水平。平行測定6 個復孔。

1.2.5 小鼠鼻腔灌洗液炎癥細胞計數(shù) 用含1%牛血清白蛋白的PBS 懸浮灌洗液底部細胞，用血細胞計數(shù)器計數(shù)白細胞。行Wright's-Giemsa 染色，計數(shù)嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量。

1.2.6 小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤情況觀察 將鼻黏膜組織置于4% 多聚甲醛中固定，制備石蠟切片。脫蠟至水。甲苯胺藍染液染色10 min，95%乙醇分化。吹干切片，二甲苯透明后封片。顯微鏡下計數(shù)6 個高倍鏡視野（×400）內肥大細胞數(shù)量，計算均值。

1.2.7 小鼠脾臟組織CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、CD4+T 細胞檢測 采用流式細胞術。小鼠脾臟組織清洗后剔除結締組織，剪碎后采用勻漿機均勻粉碎，過篩后離心脾臟單核細胞，紅細胞裂解液裂解沉淀的脾臟組織，用PBS 調整濃度為2×107/ml 細胞懸液。加入CD4、CD25、Foxp3 流式抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS 清洗2 次，PBS 重懸細胞，過篩網(wǎng)，重懸細胞后上流式細胞儀檢測CD4+T 細胞以及CD4+T 細胞群中CD25+Foxp3+Treg 細胞，計算CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 細胞比例，實驗重復3 次。

1.2.8 小鼠鼻黏膜組織TLR4/TRAF6/IκBα/NF-κB p65通路相關蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。剪碎小鼠鼻黏膜組織，加入蛋白質裂解液，勻漿機中進行勻漿（20 s），3 次，離心提取組織蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。用5%脫脂奶粉封閉2 h，清洗，加入含TLR4、TRAF6、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65 抗體的稀釋液，4 ℃過夜孵育。第2 天室溫震蕩，吸棄多余液體，再用5%脫脂奶粉封閉，加入二抗反應液，洗膜?；瘜W發(fā)光儀顯影，Chemi Capture 軟件拍照。以β-actin 為內參對照，計算各蛋白相對表達水平，實驗重復3 次。

2 結果

2.1 5 組小鼠AR 癥狀比較 5 組小鼠打噴嚏、撓鼻次數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠打噴嚏、撓鼻次數(shù)增加（均P＜0.05）。與模型組比較，抗生素組小鼠打噴嚏、撓鼻次數(shù)進一步增加（均P＜0.05），而防風水提物組小鼠打噴嚏、撓鼻次數(shù)減少（均P＜0.05）。與抗生素組比較，防風水提物+抗生素組小鼠打噴嚏、撓鼻次數(shù)減少（均P＜0.05）。見表1。

表1 5 組小鼠AR 癥狀比較（次）

2.2 5 組小鼠小鼠血清中致敏因子、炎癥細胞因子水平比較 與正常組比較，模型組小鼠血清免疫球蛋白E、組胺、白三烯、IL-4、IL-5、TNF-α 水平均升高（均P＜0.05），IL-2、IL-10、IFN-γ 水平均降低（均P＜0.05）。與模型組比較，抗生素組小鼠血清疫球蛋白E、組胺、白三烯、IL-4、IL-5 水平均升高（均P＜0.05），IL-2、IL-10 水平均降低（均P＜0.05），IFN-γ、TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；而防風水提物組小鼠血清疫球蛋白E、組胺、白三烯、IL-4、IL-5、TNF-α 水平均降低（均P＜0.05），IL-2、IL-10、IFN-γ水平均升高（均P＜0.05）。與抗生素組比較，防風水提物+抗生素組小鼠血清IgE、組胺、白三烯、IL-4、IL-5、TNF-α 水平均降低（均P＜0.05），IL-2、IL-10、IFNγ 水平均升高（均P＜0.05）。見表2。

表2 5 組小鼠血清中致敏因子、炎癥細胞因子水平比較

2.3 5 組小鼠鼻腔灌洗液中炎癥細胞因子水平比較與正常組比較，模型組小鼠鼻腔灌洗IL-6、IL-17、IL-4水平均升高（均P＜0.05），IL-10、TGF-β1 水平均降低（均P＜0.05）。與模型組比較，抗生素組小鼠IL-17、IL-4 水平均升高（均P＜0.05），IL-10、TGF-β1 水平均降低（均P＜0.05），而IL-6 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；防風水提物組小鼠IL-6、IL-17、IL-4 水平均降低（均P＜0.05），IL-10、TGF-β1 水平均升高（均P＜0.05）。與抗生素組相比，防風水提物+抗生素組小鼠IL-17、IL-4 水平均降低（均P＜0.05），IL-10、TGF-β1 水平均升高（均P＜0.05），IL-6 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 5 組小鼠鼻腔灌洗液炎癥細胞因子水平比較（pg/ml）

2.4 5 組小鼠鼻腔灌洗液中炎癥細胞數(shù)量比較 與正常組比較，模型組小鼠鼻腔灌洗液嗜酸性粒細胞、白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量均增加（均P＜0.05）。與模型組比較，抗生素組小鼠嗜酸性粒細胞、白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量均增加（均P＜0.05）；而防風水提物組小鼠嗜酸性粒細胞、白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量均減少（均P＜0.05）。與抗生素組相比，防風水提物+抗生素組小鼠嗜酸性粒細胞、白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量均減少（均P＜0.05）。見表4。

表4 5 組小鼠鼻腔灌洗液中炎癥細胞數(shù)量比較（×106/ml）

2.5 5 組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤情況比較 5組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤情況見圖1（插頁）。與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤數(shù)量增加（P＜0.05）；與模型組比較，抗生素組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤數(shù)量進一步增加（P＜0.05），而防風水提物組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤數(shù)量減少（P＜0.05）。與抗生素組相比，防風水提物+抗生素組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤數(shù)量減少（P＜0.05）。見表5。

表5 5 組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞數(shù)量比較

圖1 5 組小鼠鼻黏膜組織肥大細胞浸潤情況（箭頭示肥大細胞；甲苯胺藍染色，×400）

2.6 5 組小鼠脾臟組織CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T細胞比例比較 與正常組相比，模型組小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 細胞比例顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，抗生素組小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 細胞比例顯著降低（P＜0.05），而防風水提液組小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 細胞比例顯著增加（P＜0.05）。與抗生素組相比，防風水提物+抗生素組小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 細胞比例升高（P＜0.05）。見圖2（插頁）。

圖2 5 組小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+ T 細胞比例比較（A：流式細胞術檢測結果；B：Treg 細胞/CD4+T 細胞比例比較）

2.7 5 組小鼠鼻黏膜組織TLR4/TRAF6/IκBα/NF-κB p65 通路相關蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織TLR4、TRAF6、p-IκBα/IκBα、NF-κB p65 蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）；與模型組比較，抗生素組小鼠鼻黏膜組織TLR4、TRAF6、p-IκBα/IκBα、NF-κB p65 蛋白表達水平均升高（均P＜0.05），而防風水提液組小鼠鼻黏膜組織TLR4、TRAF6、p-IκBα/IκBα、NF-κB p65 蛋白表達水平均降低（均P＜0.05）。與抗生素組比較，防風水提物+抗生素組小鼠鼻黏膜組織TLR4、TRAF6、p-IκBα/IκBα、NF-κB p65 蛋白表達水平降低（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 5 組小鼠鼻黏膜組織TLR4、TRAF6、p-IκBα/IκBα、NF-κB p65 蛋白表達水平比較（A：蛋白表達電泳圖；B：TLR4 蛋白表達水平比較；C：TRAF6 蛋白表達水平比較；D：p-IκBα/IκBα 蛋白表達水平比較；E：NF-κB p65 蛋白表達水平比較）

3 討論

從病理生理機制來看，AR 是一種全身變態(tài)反應導致鼻部氣道黏膜發(fā)生持續(xù)慢性炎癥的過敏性疾病，機體異常的免疫反應在AR 的發(fā)生過程中發(fā)揮作用[8]。目前研究認為，Th1/Th2 細胞免疫失衡，以及Treg 細胞生成減少為AR 發(fā)生提供了免疫環(huán)境[1]。Th1細胞通過分泌IL-2、IFN-γ 等參與細胞免疫應答，Th2細胞主要通過IL-4 參與體液免疫應答，Th1/Th2 失衡與AR 的過敏反應有關[9-10]。Treg 細胞為機體發(fā)揮負向免疫調節(jié)的細胞，可通過分泌細胞因子如IL-10、TGF-β1 等抑制異常的Th2 反應，起到維持Th1/Th2 平衡的作用[8]。臨床研究表明，降低AR 患者血清Th2 型細胞因子水平，提高Treg 數(shù)量可有效緩解AR 癥狀[11]。而含防風的中藥可降低AR 患者外周IL-4、IFN-γ 水平，提示防風具有抑制Th2 型細胞因子分泌的作用[12]。

Ren 等[13]用OVA 誘導BALB/c 小鼠后，小鼠血清OVA 特異性IgE 水平升高，脾臟CD4+CD25+Treg 細胞比例降低，Th2 型細胞因子水平升高，小鼠出現(xiàn)AR 癥狀。本研究用OVA 致敏小鼠后，小鼠鼻腔組織肥大細胞和炎癥細胞浸潤增加，體內致敏IgE、組胺、白三烯含量增加，Th1/Th2 因子失衡，脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 細胞比例降低，小鼠AR 癥狀明顯。腸道微生物可通過平衡Th1 與Th2 細胞間的活動調節(jié)機體對應變原的耐受反應[14]。馮月等[15]研究指出，抗生素的過量加重了AR 小鼠出現(xiàn)腸道菌群紊亂，進一步誘導了肺組織中Th1/Th2 失衡，抑制肺組織Treg 細胞的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，在OVA 誘導小鼠后加用抗生素，小鼠的AR 癥狀進一步加重，Th1/Th2失衡，脾臟內CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞生成減少，小鼠體內致敏因子和炎癥反應程度增加。而防風水提物則對小鼠的AR 具有改善作用，其能誘導脾臟內Treg 細胞的生成，增加Treg 型IL-10、TGF-β1 水平，并能抑制Th2 型細胞因子IL-4 的分泌，降低小鼠體內致敏因子含量和炎癥反應程度，且對抗生素加重的小鼠AR 也具有顯著改善作用和相同的免疫調節(jié)作用。

屈映等[16]通過網(wǎng)絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)防風的免疫調節(jié)作用與抑制TLR 有關。TLR4 表達于免疫細胞表面識別包括過敏原在內的外來抗原的成分，可激發(fā)免疫細胞應答的發(fā)生，并能誘導Th2 細胞的分化[17-19]。徐琛等[20]研究表明，抑制鼻黏膜TLR4/NF-κB p65 通路的激活，可降低炎癥細胞因子水平而對大鼠AR 具有治療作用。TLR4/TRAF6/NF-κB p65 通路激活可引起Th1/Th2 細胞失衡，其作用機制為TLR4 激活后促進ARAF6蛋白表達，后者激活炎癥介質關鍵效應轉錄子NF-κB信號，發(fā)揮細胞的炎癥反應作用[21-22]。IκBα對NF-κB激活釋放炎性因子釋放十分關鍵，Zhu 等[23]發(fā)現(xiàn)抑制IκBα磷酸化表達能夠減少NF-κB 介導的炎癥因子IL-6、TNF-α的釋放。侯道榮等[24]用脂多糖誘導細胞炎癥后，細胞內TLR4、p-IκBα/IκBα、NF-κB p65 蛋白表達激活。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、TRAF6、p-IκBα/IκBα、NF-κB p65在OVA誘導的小鼠鼻黏膜組織中顯著表達，在加用抗生素后這些分子蛋白的表達更為顯著，提示抗生素能夠促進TLR4/TRAF6/IκBα/NF-κB p65 通路表達，進一步誘導機體免疫失衡，加重小鼠AR癥狀。而防風水提物干預后，小鼠鼻黏膜組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65以及p-IκBα/IκBα的表達均下降，提示防風水提物可通過抑制小鼠鼻黏膜中激活的TLR4/TRAF6/IκBα/NF-κB p65，調節(jié)小鼠機體免疫，從而改善AR癥狀。

綜上所述，抗生素加劇了OVA 誘導小鼠的AR 癥狀，而防風水提物具有改善小鼠AR 的作用，其機制可能與抑制小鼠鼻黏膜組織TLR4/TRAF6/IκBα/NF-κB p65 通路激活，改善免疫反應有關。