孫萌，劉雪純，趙玥瑛，張晴，席鋮，董爽，張馨雨，杜守穎，白潔，陸洋（北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488）

散偏湯為國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中的第98方，為治頭痛要方，出自清代陳士鐸所著的《辨證錄》[1]頭痛門卷之二，由川芎、白芍、白芥子、甘草、郁李仁、白芷、香附、柴胡8味藥組成，功效為疏肝解郁、祛風止痛，用于治療郁氣不宣，風邪襲于少陽經(jīng)之半邊頭風。方中川芎為君藥，外散風邪，入肝膽經(jīng)，善治頭痛；白芍和甘草合用酸甘化陰、緩急止痛，柴胡和香附合用疏利肝膽、和解少陽，白芷解表散寒、祛風止痛，白芥子溫肺化痰、通絡止痛，以上6味共為臣藥；郁李仁藥性主降，助川芎散之太過，為佐藥；甘草為使藥，可調(diào)和諸藥。現(xiàn)代臨床報道散偏湯可用于治療血管神經(jīng)型偏頭痛、急性缺血性中風偏癱、抑郁癥、多囊卵巢綜合征等疾病[2-5]。散偏湯傳統(tǒng)劑型為湯劑，需要臨時煎煮，費時費力，且不易保存[6]，將其開發(fā)成顆粒劑能夠克服以上缺點，同時亦能保證其藥性、藥效，在臨床應用上具有重要意義。

根據(jù)經(jīng)典名方顆粒劑開發(fā)研究的相關(guān)文件，顆粒劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）應與基準樣品保持一致，CQAs包括指紋圖譜相似度、指標性成分含量以及出膏率。經(jīng)典名方顆粒劑的工藝研究并非以CQAs最高為目的，而是要保證顆粒劑的CQAs與基準樣品的質(zhì)量標準范圍具有較好的一致性，這就給經(jīng)典名方顆粒劑的工藝研究帶來了挑戰(zhàn)。Box-Behnken設計-響應面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）采用多元回歸方程來擬合因素和效應值之間的函數(shù)關(guān)系，針對目標工藝水平進行工藝參數(shù)的預測和優(yōu)化[7-10]，該方法能夠有效解決經(jīng)典名方顆粒劑工藝研究面臨的困難。為保證提取液的CQAs能夠達到散偏湯基準樣品的質(zhì)量標準范圍，本研究依據(jù)前期確定的基準樣品標準[11]選取阿魏酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草苷和甘草酸含量以及出膏率為綜合評分的指標，采取Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JM-B10002電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；賽多利斯BSA224S電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達圣科技有限公司）；DZ47SD20型真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；G20型醫(yī)用離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（DAD檢測器，四元低壓梯度泵，柱溫箱，自動進樣器，LC Solution色譜工作站）[島津（中國）有限公司]；Thermo UItimate3000高效液相色譜儀（DAD檢測器，CM7.2色譜工作站）[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2 試藥

阿魏酸（批號：110773-201915，含量：99.0%）、芥子堿硫氰酸鹽（批號：111702-202006，含量：98.3%）、甘草苷（批號：111610-201908，含量：93.1%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，含量：97.7%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher公司，色譜純）；乙醇（分析純）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

川芎飲片（批號：2009072，產(chǎn)地四川眉山）、白芍飲片（批號：200623，產(chǎn)地安徽亳州）、白芥子飲片（批號：200213，產(chǎn)地四川南充）、甘草飲片（批號：201804-3，產(chǎn)地甘肅武威）、柴胡飲片（批號：TS-4，產(chǎn)地甘肅康樂）、郁李仁飲片（批號：160944，產(chǎn)地甘肅天水）、白芷飲片（批號：201801-4，產(chǎn)地四川遂寧）、香附飲片（批號：2009080，產(chǎn)地河南開封）（億帆醫(yī)藥股份有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定）。

2 方法與結(jié)果

2.1 散偏湯基準樣品的制備

取處方量飲片（川芎38 g，白芍19 g，白芥子11 g，甘草4 g，柴胡4 g，郁李仁4 g，白芷2 g，香附8 g）于陶瓷鍋中，加水630 mL，放置浸泡30 min，武火（1500 W）煎沸后文火（300 W）煎煮45 min，趁熱用1層300目尼龍布過濾；濾渣加水540 mL，武火（1500 W）煎沸后文火（300 W）煎煮35 min，趁熱過濾，合并兩次濾液，冷卻，調(diào)整體積至600 mL，即得散偏湯水煎液。精密移取散偏湯水煎液10 mL于30 mL西林瓶中，冰箱-20℃預冷凍12 h左右，轉(zhuǎn)移至-80℃的真空凍干機（真空度為＜10 Pa）凍干72 h，取出后壓蓋密塞，即得散偏湯基準樣品。

2.2 指標性成分含量測定方法

2.2.1 色譜條件

① 色譜條件1：色譜柱：Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫（0～10 min，2%乙腈；10～18 min，2%～6%乙腈；18～45 min，6%～10%乙腈；45～90 min，10%～15%乙腈；90～110 min，15%～95%乙腈）；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；波長：321 nm，用于阿魏酸和芥子堿硫氰酸鹽的含量測定。

② 色譜條件2：色譜柱：資生堂CAPCELLPAKC18MGS5（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫（0～8 min，19%～20%乙腈；8～20 min，20%～33%乙腈；20～40 min，33%～50%乙腈；40～45 min，50%～100%乙腈；45～49 min，100%～19%乙腈）；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；波長：237 nm，用于甘草苷和甘草酸的含量測定。

2.2.2 方法學考察[11]根據(jù)《中國藥典》2020年版方法[12]，按照“2.2.1”項下色譜條件對含量測定方法進行方法學考察，結(jié)果見表1，各考察指標均符合要求。

表1 散偏湯中指標性成分含量測定的方法學考察Tab 1 Methodological investigation on the content determination of index component in the Sanpian decoction

2.2.3 供試品溶液的制備

① 基準樣品：取散偏湯基準樣品2份，于西林瓶中加適量水超聲（250 W，40 kHz）溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容至刻度，混勻后取5 mL于離心管，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得基準樣品供試品溶液。

② 提取液：稱取處方量飲片于圓底燒瓶中，加適量水，放置浸泡30 min，回流一段時間，用1層300目的尼龍布趁熱過濾，冷卻；調(diào)整濾液體積一致，取5 mL于離心管中，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得提取液供試品溶液。

2.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品9.50 mg于10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，得到940.50 μg·mL-1的阿魏酸對照品母液，用70%甲醇稀釋成47.03 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液。精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品9.85 mg于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得到968.26 μg·mL-1的芥子堿硫氰酸鹽對照品母液，用甲醇稀釋成96.83 μg·mL-1的芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液。

分別精密稱取甘草苷對照品9.69 mg、甘草酸銨對照品10.05 mg于10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，分別得到902.14 μg·mL-1、1002.21 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸對照品母液，用70%乙醇稀釋，分別得到90.21 μg·mL-1、96.20 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸對照品溶液。

2.3 出膏率測定

2.3.1 基準樣品出膏率的測定 按“2.1”項下方法制備基準樣品，移取水煎液200 mL至蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上濃縮至稠膏狀，60℃真空干燥72 h，即得散偏湯基準樣品干膏，按照公式（1）計算得出膏率；出膏率（%）＝（所得干膏重×水煎液總體積）/（藥味稱樣量×取樣體積）×100% （1）

2.3.2 提取液出膏率的測定 將供試品制備后剩余的藥液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，濃縮至適當體積后，置于水浴鍋上濃縮至稠膏狀，60℃真空干燥72 h，按照公式（1）計算得出膏率。

2.4 單因素試驗

2.4.1 加水倍量的考察 稱取處方量飲片于圓底燒瓶中，分別加入散偏湯處方量飲片5倍（450 mL）、10倍（900 mL）、15倍（1350 mL）、20倍（1800 mL）水，放置浸泡30 min，回流提取80 min，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行兩份，測定并取平均值。

結(jié)果見圖1，由圖1可知，4種指標性成分的含量及出膏率均隨加水倍量的增加而增加，在5倍量時最低，20倍量時最高，15倍到20倍變化不明顯，總體呈現(xiàn)一個向上的趨勢。高于20倍的加水量對指標性成分含量及出膏率提高作用不明顯，為避免資源浪費，不再選擇更高的加水倍量，選擇5倍加水量為低水平，20倍加水量為高水平。

圖1 不同加水倍量下各指標性成分含量（A）及出膏率（B）（n＝2）Fig 1 Content of each index component（A）and extract yield（B）at different water times（n＝2）

2.4.2 提取時間的考察 稱取處方量散偏湯飲片于圓底燒瓶中，加入處方量13倍量（1170 mL）水浸泡30 min，分別回流提取時60、90、120、150 min，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行兩份，測定并取平均值。

結(jié)果見圖2，由圖2可知，出膏率在60 min時最低，150 min時最高，總體呈現(xiàn)一個向上的趨勢。4個指標性成分含量特別是芥子堿硫氰酸鹽和甘草苷的含量，隨著提取時間總體上變化不大，除阿魏酸外，其他3種指標性成分含量均在90 min時有最高值，而阿魏酸含量則與提取時間成正相關(guān)。阿魏酸不穩(wěn)定，濃縮、干燥過程中損失率最大，甘草酸損失率最小，所以雖然甘草酸在150 min含量最低，但為最大程度保證提取液中指標性成分的含量，故選擇60 min為低水平，150 min為高水平。

圖2 不同提取時間下各指標性成分含量（A）及出膏率（B）（n＝2）Fig 2 Contents of each index components（A）and extract yield（B）at different extraction time（n＝2）

2.5 Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)化散偏湯提取工藝

2.5.1 因素水平設計 選取提取時間A（60 min、105 min、150 min），加水倍量B（5倍、12.5倍、20倍），提取次數(shù)C（1次、2次、3次）三因素進行響應面試驗設計。以4個指標性成分含量（Y1：阿魏酸含量；Y2：芥子堿硫氰酸鹽含量；Y3：甘草苷含量；Y4：甘草酸含量）和出膏率（Y5）為評價指標，采用Design Expert 10.0軟件進行響應面設計和數(shù)據(jù)分析，篩選出最佳提取工藝。

前期試驗中發(fā)現(xiàn)，在“提取-濃縮-干燥”過程中，4個指標性成分均有一定損失，阿魏酸損失率約為40%，芥子堿硫氰酸鹽損失率約為25%，甘草苷損失率約為20%，甘草酸損失率約為5%。因此，選取各指標性成分含量及出膏率作為評價指標進行綜合加權(quán)評分，設置權(quán)重系數(shù)均為0.2，同時將各成分損失率折算，進行綜合評分，綜合評分值越接近0則越接近基準樣品要求。綜合評分公式如下：

綜合評分＝0.2×（提取液中阿魏酸含量-1.40×基準樣品中阿魏酸含量）+0.2×（提取液中芥子堿硫氰酸鹽含量-1.25×基準樣品中芥子堿硫氰酸鹽含量）+0.2×（提取液中甘草苷含量-1.20×基準樣品中甘草苷含量）+0.2×（提取液中甘草酸含量-1.05×基準樣品中甘草酸含量）+0.2×（提取液出膏率-基準樣品出膏率）（2）

根據(jù)Design Expert 10.0軟件進行三因素三水平的17次試驗，其中12個析因點，5個中心點，因素水平表見表2，試驗設計見表3，結(jié)果見表4。

表2 響應面試驗設計因素水平表Tab 2 Factor and level of response surface methodology

表3 Box-Behnken設計-響應面法試驗設計Tab 3 Box-Behnken design-response surface methodology

表4 響應面試驗結(jié)果Tab 4 Response surface methodology

2.5.2 模型建立與評價 根據(jù)17組試驗結(jié)果，采用二項式回歸對綜合評分及對應的因素（提取時間、加水倍量、提取次數(shù)）進行擬合，得到的回歸方程：綜合評分＝9.19+1.12A+7.99B+11.56C+3.84AB-0.25AC-1.95BC+0.53A2-2.04B2-2.88C2。

對擬合模型進行ANOVA方差分析，結(jié)果見表5。該模型的方差P＝0.0001，顯著；模型的失擬項P值為0.0589＞0.05，不顯著，方差顯著而失擬項不顯著，表明該模型有統(tǒng)計學意義，且模型與實際值能較好地擬合。模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.9711，調(diào)整決定系數(shù)R2adj＝0.9340，說明該模型能解釋93.40%響應值的變化，可信度較好，可以運用該模型分析。

表5 方差分析結(jié)果Tab 5 Analysis of variance

該模型中，因素B、C的P值均＜0.0001，表明加水倍量、提取次數(shù)對綜合評分的影響較顯著，3個因素對綜合評分的影響順序為提取次數(shù)＞加水倍量＞提取時間。此外，根據(jù)等高線圖和3D圖可知，因素A、B、C之間還存在交互作用，具體的響應面分析見圖3。3個交互作用中，圖3C的響應面圖坡度最陡，圖3B的次之，圖3A的響應面圖坡度最平緩，表明加水倍量與提取次數(shù)的交互作用最強，對綜合評分的影響最大，提取時間與加水倍量的交互作用較弱，對綜合評分的影響最小。

圖3 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖及等高線圖Fig 3 Response surface and contour plot of interactive effect on the comprehensive score

2.5.3 預測最優(yōu)工藝參數(shù) 采用Design Expert 10.0軟件預測的提取工藝參數(shù)為提取時間60.0 min，加水倍量20.0倍，提取次數(shù)1.1次，此時的綜合評分預測值為0.0。根據(jù)實際情況對提取工藝參數(shù)進行調(diào)整，即加水20倍量（1800 mL）、提取60 min、提取1次。

2.5.4 驗證試驗 按照調(diào)整后的預測工藝參數(shù)進行響應面驗證試驗，結(jié)果見表6。

表6 響應面驗證試驗結(jié)果(x±s，n＝3)Tab 6 Verification test of response surface (x±s，n＝3)

3 討論

經(jīng)典名方是歷代醫(yī)家臨床實踐經(jīng)驗的總結(jié)，對經(jīng)典名方的研究和開發(fā)既能實現(xiàn)中藥劑型現(xiàn)代化創(chuàng)新，也能夠推動中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展。經(jīng)典名方作為體現(xiàn)中藥復方配伍理論的重要載體，往往是由多種成分共同作用而起效的，不同的制備工藝參數(shù)往往會導致其成分組成和相對含量的變化，因此制備工藝研究是經(jīng)典名方開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本研究以單因素試驗確定了加水倍量和提取時間的上下限，在單因素試驗基礎上設計了Box-Behnken設計-響應面法試驗，以提取液中4個指標性成分含量及出膏率為指標，通過試驗設計及綜合加權(quán)評分對不同提取條件的結(jié)果進行直觀分析，優(yōu)選散偏湯提取工藝，并通過試驗驗證了優(yōu)選工藝的可行性。試驗發(fā)現(xiàn)，不同提取條件下的水煎液的指紋圖譜相似度與基準樣品標準比均大于0.9，相似度良好，說明不同提取條件下指紋圖譜相似度差異不大，故雖然指紋圖譜相似度屬于CQAs，但在考察提取工藝時未將指紋圖譜相似度納入評分標準。

本研究在散偏湯飲片回流提取之前采取先將飲片浸泡30 min的方法，其原因在于前期研究發(fā)現(xiàn)浸泡后4個指標性成分含量相較于不浸泡組均有升高，且前期基準樣品的制備也采用了飲片浸泡30 min的方法，基準樣品是制劑工藝篩選及制劑標準制訂的依據(jù)和準繩[13]，為了保持一致性，故在提取工藝的考察部分試驗仍繼續(xù)采用飲片浸泡30 min的方法。

前期考察發(fā)現(xiàn)在提取-濃縮-干燥過程中，阿魏酸的損失率高達40%，其原因為阿魏酸以溶液狀態(tài)存在時不穩(wěn)定，易受外界和溶液環(huán)境等因素的影響，在高溫及光照情況下易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[14-15]，因此在考察提取時間時充分考慮了阿魏酸損失率高的實際情況，選取阿魏酸含量較高的150 min為高水平。

根據(jù)前期試驗結(jié)果，15批基準樣品中，4個指標性成分含量已確定的范圍為：每個處方含阿魏酸19.08～35.43 mg，芥子堿硫氰酸鹽38.02～70.60 mg，甘草苷14.65～27.21 mg，甘草酸21.17～39.31 mg。試驗最終優(yōu)選散偏湯提取工藝為加水20倍（1800 mL），浸泡30 min，提取60 min，提取1次，根據(jù)3組驗證試驗結(jié)果，得到每個處方中阿魏酸含量均值為40.54 mg、芥子堿硫氰酸鹽含量均值為70.87 mg、甘草苷含量均值為22.30 mg、甘草酸含量均值為40.63 mg，出膏率均值為23.83%，綜合評分為-3.9655，驗證試驗結(jié)果減去“提取-濃縮-干燥”過程的損失，均滿足前期建立的質(zhì)量標準，且與響應面法預測值接近，表明該提取工藝可以用于后續(xù)的試驗。