楊小錄 王一峰 何九軍 孫 杰 陳 強(qiáng) 王永斌

（1 隴南師范高等?？茖W(xué)校 甘肅 成縣 742500； 2 隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心 甘肅 成縣 742500）

葛(Pueraria montana (Loureiro) Merrill)，又稱野葛，葛根，是豆科植物葛屬多年生藤本。塊狀根肥大，復(fù)葉，總狀花序，莢果。葛在我國分布極廣，除西藏等地外，均有分布[1]。葛有較高的經(jīng)濟(jì)價值，葛富含人體必需的礦質(zhì)元素，葉片、莖有較多的蛋白質(zhì)、粗纖維和異黃酮類化合物[2]，是很好的動物飼料和藥材原料。葛根含有葛根素、總黃酮等，對血管有一定的擴(kuò)張作用；葛花富含多種礦質(zhì)元素和氨基酸；葛的莖纖維素含量很高，單纖維長度可達(dá)0.95 ~4.2 cm，是用途廣泛的纖維植物。葛有較高的食用、藥用、飼用以及生態(tài)等價值[3]，尤其是葛根黃酮在心腦血管、抗衰老、抗疲勞、抗氧化等方面有一定的功效[4]，其人工種植引起了人們的廣泛關(guān)注。隴南有較大面積的人工種植葛，由于隴南春季3~5 月間易發(fā)生倒春寒，引發(fā)植物的冷凍害，對葛的生長也有一定的影響。本文通過對2 年生葛春季新展葉人工模擬低溫脅迫，研究低溫脅迫對葛的葉綠素、丙二醛(MDA)含量的影響，為葛的人工栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。試驗用葛葉片來自隴南師范高等專科學(xué)校智能溫室，為2 年生扦插苗。4 月底進(jìn)行采集和試驗。

1.2 試驗方法。采集沒有病蟲害的葛葉片，將葉片上的灰塵、污漬用紗布拭去，裝入食品自封袋中，分別置于常溫(處理1，CK)、10 ℃(處理2)、5 ℃(處理3)、0 ℃(處理4)、-5 ℃(處理5)、-10 ℃(處理6)下處理，以常溫處理為對照，每個處理設(shè)3 次重復(fù)，每1 組處理12 h，12 h 后進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 葉綠素及類胡蘿卜素含量的測定。葛葉片用95%的乙醇充分研磨，用分光光度計分別在470 nm、645 nm、669 nm 波長下測定吸光值，并根據(jù)公式計算出葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量[5]。

1.3.2 丙二醛含量的測定。參考林艷[6]等的方法測定丙二醛含量。將葛葉片擦拭干凈，精確稱0.1 g，剪碎后放入研缽，加10%的TCA(三氯乙酸)2 ml，研磨成勻漿，繼續(xù)加3 ml TCA 研磨，研磨液轉(zhuǎn)入離心管，離心機(jī)4 000 r/min 離心10 min。取離心管中的上清液2 ml 至空白試管，加0.6%TBA(硫代巴比妥酸)2 ml，100 ℃水浴中恒溫處理15 min，15 min 后取出，待試管冷卻，測其在600 nm、532 nm、450 nm 波長的吸光值。計算公式：CMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450；式中CMDA為丙二醛(MDA)含量，A600、A532、A450分別表示在600 nm、532 nm、450 nm 測得的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理。試驗數(shù)據(jù)用SPSS 23 進(jìn)行單因素方差分析，用EXCEL 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對葛葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響。由表1 看出，隨脅迫溫度的降低，葛春季新展葉的葉綠素、類胡蘿卜素的含量整體變化不明顯，但脅迫溫度為-5 ℃時，葉綠素a、葉綠素b 以及葉綠素a + b的含量均達(dá)到最低值。葉綠素a、葉綠素b 以及葉綠素a+b、類胡蘿卜素含量在脅迫溫度范圍內(nèi)，與CK相比變化較小(P＞0.05)。由表2 可知，在低溫處理下，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b 以及類胡蘿卜素含量無差異(P＞0.05)。

表1 低溫對葛葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響

表2 低溫對葛葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量影響的方差分析

2.2 低溫對葛葉片丙二醛(MDA)含量的影響。丙二醛(MDA)是植物膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，在植物抗逆性研究中丙二醛的含量為常用指標(biāo)，丙二醛含量的增加標(biāo)志著膜損傷的加劇。從圖1 看出，葛葉片MDA 含量在-10℃時達(dá)到最高值，是CK 的2.96 倍，說明在此溫度下，膜損傷嚴(yán)重。脅迫溫度范圍在0℃~10℃時，MDA 含量變化不大(P＞0.05)，脅迫溫度低于0 ℃時，MDA 含量與CK 相比，有差異(P＜0.05)，與孫佳平[7]等人研究結(jié)果相同。從表3 可以看出，在不同低溫處理下，葛葉片中MDA 的含量有顯著差異(P ＜0.01)。

表3 低溫對葛葉片MDA 含量影響的方差分析

圖1 低溫對葛葉丙二醛(MDA) 含量的影響

2.3 低溫對葛葉片形態(tài)的影響。從圖2 可以看出，葛葉片經(jīng)過低溫脅迫后，形態(tài)上發(fā)生變化，其中0 ℃~10 ℃的脅迫對葉片形態(tài)的影響基本沒有太大的差別，但是處理溫度低于0℃時，葛葉片的葉色變化較大，葉片失去光澤度，葉色加深，葉片手感變軟，有細(xì)胞失水的表現(xiàn)，與徐衛(wèi)平[8]等研究結(jié)果相同。

圖2 低溫對葛葉片形態(tài)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 葉綠素及類胡蘿卜素在植物的光合作用過程中起著非常重要的作用，葉綠素a 和葉綠素b 共同組成光合原初反應(yīng)天線色素和作用中心色素，類胡蘿卜素是光合作用中的重要輔助色素，具有吸收、傳遞光能的作用[9]。葉綠素含量的高低與其光合作用的能力有一定的關(guān)聯(lián)。在本試驗中，隨脅迫溫度的降低，葉綠素和類胡蘿卜素的含量整體呈下降趨勢，表明其光合作用能力下降。王瑞霞[10]等研究低溫對小麥的影響中發(fā)現(xiàn)，低溫會引起小麥葉綠素含量的下降，導(dǎo)致光合速率、蒸騰速率以及氣孔導(dǎo)度的下降。張瑤[11]等研究低溫對黃瓜葉片光合作用的影響中發(fā)現(xiàn)，隨溫度的降低，葉綠素a、葉綠素b 及類胡蘿卜素含量均有所下降，影響植物的光合作用。

3.2 低溫條件下，植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，積累了較多的氧自由基和活性氧，氧自由基和活性氧攻擊膜系統(tǒng)，對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害[12]，導(dǎo)致MDA 含量增加，MDA 含量的增加一定程度上反映了膜受傷害的程度，也能反映植物的抗寒能力[13]。MDA是一種過氧化產(chǎn)物，其值與植物抗逆性有負(fù)相關(guān)[7]。在試驗中，隨脅迫溫度的降低，MDA 的含量逐漸增加，在-10℃時含量最高。

3.3 低溫脅迫是常見的非生物脅迫之一，尤其是春季的倒春寒，對植物的危害更大。植物遭受低溫脅迫時，其外部形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化等性質(zhì)都會受到影響。在對甘蔗、番茄、水稻、小麥等作物的研究中發(fā)現(xiàn)，對低溫脅迫應(yīng)答的是miRNAS。在對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，miR397、miR408、393、168 等數(shù)十個miRNAS 表達(dá)了上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量超過了1.5 倍[14]。miRNAS 通過抑制或者降解基因翻譯，調(diào)控植物對低溫的應(yīng)答過程，其調(diào)控模式有多種[15]。

3.4 王達(dá)[16]等人研究認(rèn)為，植物對低溫的應(yīng)對是非常復(fù)雜的過程，在植物體內(nèi)有一系列的物質(zhì)可以對低溫逆境進(jìn)行應(yīng)激應(yīng)答，這些物質(zhì)主要有抗凍蛋白、脯氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)等，這些物質(zhì)共同作用來維持植物細(xì)胞滲透壓、水勢平衡，并通過氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡以降低或抑制細(xì)胞結(jié)冰，增加植物對低溫的抵御能力。

綜上，葛在低溫的脅迫下，其葉綠素含量總體下降，MDA 含量上升。低溫對植物的脅迫機(jī)理較為復(fù)雜，期待后期更深入的探究。