張曉云，傅棟桁，張一帆，李亞妮，古麗米熱·熱合滿，安 妮，梅曉宏*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100083）

長期高脂膳食（High fat diet，HFD）會(huì)導(dǎo)致機(jī)體能量攝入與消耗不平衡，引發(fā)糖脂代謝紊亂[1]，繼而增加高血脂、高血糖、心血管疾病等多種慢性疾病的發(fā)病率[2-3]，給人類的生命健康帶來極大的危害。如何有效預(yù)防肥胖，改善血脂異常，降低高血糖成為全社會(huì)的關(guān)注焦點(diǎn)。當(dāng)前改善脂代謝紊亂，降低高血糖的方法尚存在治療效果不佳、安全性低等問題[4-5]。從天然產(chǎn)物中提取高效、安全的活性成分，用于預(yù)防或改善糖脂代謝紊亂，成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)之一。

植物甾醇是一種廣泛存在于植物中的天然甾體類生物活性物質(zhì)，因與膽固醇具有極其相似的結(jié)構(gòu)，可競爭性地抑制腸道對膽固醇的吸收，從而有效降低血液中膽固醇的含量[6]。此外，相關(guān)研究表明植物甾醇對2 型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）和妊娠期糖尿?。℅estational diabetes mellitus，GDM）具有一定的改善作用[7-9]。然而，植物甾醇不溶于水、脂溶性低的特點(diǎn)限制了在食品行業(yè)的廣泛應(yīng)用[10]。為了改善植物甾醇的油溶性，主要通過化學(xué)合成法、酶催化合成法以及離子液體催化合成法將植物甾醇與脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸酐等反應(yīng)制備植物甾醇酯[11]，可有效改善植物甾醇在油脂類食品中的應(yīng)用[12]。然而，大量油脂的引入，會(huì)導(dǎo)致一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，大部分食品都是含水體系，使得如何提高植物甾醇水溶性成為食品領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。乳化法和包埋法是目前制備水溶性植物甾醇的主要方法[13]。用于食品中的乳化劑種類和用量受到嚴(yán)格的限制，開發(fā)天然、生物相容性好的高分子化合物（如蛋白質(zhì)、多糖及其蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物）作為乳化劑和包埋材料成為該領(lǐng)域的主要研究方向，如利用乳化蒸發(fā)技術(shù)構(gòu)建食用蛋白質(zhì)（如大豆蛋白、乳清蛋白和酪蛋白酸鈉）植物甾醇納米顆粒，提高植物甾醇的溶解性和生物利用率[14]；以大豆蛋白-甜菊糖苷復(fù)合體作為穩(wěn)定劑制備植物甾醇納米乳液[15]等。

在前期工作中，通過乳化蒸發(fā)技術(shù)制備出的基于酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物的植物甾醇納米顆粒，平均粒徑（283.73±14.70）nm，電位（-24.7±0.16）mV，體外胃腸模擬消化中植物甾醇釋放率分別為4.73%和52.19%[16]，其對植物甾醇的包封率為80%左右，體外模擬消化及Caco-2 細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物包封的植物甾醇體外釋放率及生物利用率顯著高于游離植物甾醇[17]。若將該植物甾醇納米顆粒應(yīng)用于食品體系中發(fā)揮其降血脂和降血糖的功效，需對其功效進(jìn)行深入的分析。本研究基于酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物的植物甾醇納米納米分散液，研究改善高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠的降血脂和降血糖作用，為該植物甾醇納米體系在食品中的應(yīng)用和推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

1.1.1 受試動(dòng)物 SPF 級(jí)6 周齡C57BL/6J 雄性小鼠45 只，體質(zhì)量（20±2）g，由北京市維通利華有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006。

1.1.2 材料 普通飼料（能量14.23 kJ/g）、高脂飼料（能量21.93 kJ/g），北京市澳科有限公司，其成分及供能比例如表1所示；植物甾醇（純度≥95%），西安國邦實(shí)業(yè)有限公司；酪蛋白酸鈉，新西蘭恒天然公司；葡聚糖40，上海麥克林生化科技有限公司；Trizol 裂解液，美國Ambion 公司；TransScript Green qPCR 試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；SuperReal 熒光定量試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司。

表1 基礎(chǔ)飼料和高脂飼料成分及供能比例Table 1 Composition and energy supply ratio of basic feed and high-fat feed

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-25C 冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；-80 ℃超低溫冰箱，日本SANYO 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf 公司；干燥箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司；熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物的制備準(zhǔn)確稱取酪蛋白酸鈉和葡聚糖40 按照質(zhì)量比1 ∶5 溶于超純水中，用0.1 mol/L 氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)pH 值到7，在0.015 MPa、-80 ℃下冷凍干燥48 h 后，將混合的酪蛋白酸鈉和葡聚糖粉末在相對濕度79%（飽和溴化鉀溶液）和60 ℃的干燥器中處理36 h，制備糖基化復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過40 目篩，收集制備的粉末樣品儲(chǔ)藏于-20 ℃下備用。

1.3.2 酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物穩(wěn)定的植物甾醇納米分散液的制備 將1.3.1 節(jié)制備好的1 g 糖基化復(fù)合物溶解在100 mL 超純水中，在溫度50 ℃、功率100 W 和振蕩頻率20 kHZ 條件下超聲至糖基化復(fù)合物完全溶解，將0.05 g 植物甾醇溶解在10 mL 的45 ℃的乙醇中。溶有植物甾醇的乙醇和糖基化復(fù)合物水溶液以體積比1∶5 混合，用超聲波細(xì)胞破碎儀在功率250 W 的條件下進(jìn)行超聲處理20 min，然后在55 ℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min，除去乙醇，得到植物甾醇納米分散液（Phytosterol nano-dispersion，PSND）。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)過了中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)KY19016。該實(shí)驗(yàn)在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京）的SPF 級(jí)動(dòng)物房（合格證號(hào)：SYXK（京）2015-0045）中進(jìn)行，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，空氣每小時(shí)交換15 次，12 h 光照，12 h 黑夜。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠依據(jù)平均體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組，分別為正常對照組（CK 組）、高脂飲食組（HFD 組）、空載組（N 組）、低劑量PSND 處理組（L 組）、中劑量PSND 處理組（M 組）和高劑量PSND 處理組（H 組）。每組9 只，每籠3 只，CK 組給予基礎(chǔ)飼料，HFD、N、L、M、H組均給予高脂飼料，同時(shí)N 組的飲用水為0.5 mg/mL 酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物分散液，L、M 和H 組小鼠的飲用水分別為0.3，0.5，0.7 mg/mL的基于酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物的PSND，CK 和HFD 組飲用超純水。小鼠自由飲食和飲水，飼喂18 周。每日觀察小鼠表觀特征、精神狀態(tài)和肢體行為是否正常，是否有出現(xiàn)中毒和死亡的情況，并記錄。

1.3.4 檢測指標(biāo)

1.3.4.1 體質(zhì)量測定 每周同一時(shí)間稱量小鼠的體質(zhì)量、攝食量和飲水量并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.4.2 空腹血糖的測定 實(shí)驗(yàn)15 周末期，小鼠禁食10～12 h 后，通過尾靜脈采血，用血糖儀監(jiān)測小鼠空腹血糖水平。

1.3.4.3 小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（Glucose tolerance test，GTT）實(shí)驗(yàn)16 周末期，小鼠禁食16 h，正常飲水，腹腔注射1.5 g/kg bw 葡萄糖溶液，尾靜脈采血，用血糖儀測定每只小鼠注射后0，15，30，60，90，120 min 血糖值。

1.3.4.4 小鼠胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（Insulin tolerance test，ITT）實(shí)驗(yàn)17 周末期，小鼠禁食4 h，正常飲水，腹腔注射0.5 U/kg bw 的胰島素溶液，尾靜脈采血，用血糖儀測定每只小鼠注射后0，15，30，45，60 min 的血糖值。

1.3.4.5 血清生化指標(biāo)的測定 實(shí)驗(yàn)18 周末期，小鼠禁食16 h，稱重，眼眶取血置于1.5 mL 離心管中，靜置2 h，于4 ℃下3 000 r/min 離心15 min，取血清。采用自動(dòng)血生化分析儀測定血生化指標(biāo)，包括：總甘油三酯（Total triglycerides，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（Low -density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白-膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）。

1.3.4.6 小鼠脂肪質(zhì)量和臟器指數(shù)的測定 小鼠眼眶取血后，頸椎脫臼處死，快速分離皮下脂肪（Subcutaneous fat，SUB）、附睪脂肪（Epididymal fat，EP）、棕色脂肪（Brown fat，BAT）和肝臟，用生理鹽水漂洗臟器，濾紙吸干，稱量臟器、組織質(zhì)量并記錄，隨后放入凍存管于-80 ℃下凍存?zhèn)溆?。根?jù)以下公式計(jì)算小鼠臟器指數(shù)。

1.3.4.7 組織切片染色觀察 取同一部位的脂肪組織，用10%福爾馬林固定液固定后，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，H&E 染色，染色切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和圖像分析。

1.3.4.8 肝臟mRNA 提取與檢測 Trizol 提取法提取肝組織總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。再使用熒光定量試劑盒對3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA reductase，HMGCR）、低密度脂蛋白受體（Low-density lipoprotein receptor，LDL-R）和膽固醇7α-羥化酶（Cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和檢測。所涉及的基因引物序列如表2所示，使用Real-Time PCR 儀測定Ct 值，以βactin 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算結(jié)果。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel 和SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）中的Duncan 多重比較分析組間差異性。*表示與HFD 組相比具有顯著性差異（P＜0.05），** 表示與HFD 組相比具有極顯著性差異（P＜0.01），*** 表示與HFD 組相比具有極其顯著性差異（P＜0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSND 對小鼠日飲食量和日飲水量的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠精神狀態(tài)和肢體行為均正常，攝食飲水排便無異常，沒有出現(xiàn)中毒和死亡的情況。從表3 可以看出，與CK 組相比，高脂飲食會(huì)極顯著降低小鼠的飲水量（P＜0.01），這與劉妍等[18]的研究結(jié)果一致；N 組和HFD 組飲水量沒有顯著性差異，表明在小鼠飲用水中添加酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物并未影響肥胖小鼠的飲水量；L、M 和H 組小鼠飲水量分別為4.87，5.16 mL/d 和5.38 mL/d 【相當(dāng)于分別攝入34.3，64.1 mg/（kg·d）和97.9 mg/（kg·d）的植物甾醇】，顯著或極顯著高于HFD 組。與CK 組相比，HFD 組、N 組、L 組、M 組飲食量雖略有下降，但是并無顯著性差異，而高劑量PSND 干預(yù)組（H 組）明顯抑制肥胖小鼠的食欲（P＜0.05）。

表3 小鼠飲食量和飲水量Table 3 Food and water intake of mice

2.2 PSND 對小鼠生長指標(biāo)的影響

2.2.1 PSND 對小鼠體質(zhì)量的影響 評(píng)價(jià)動(dòng)物能量代謝變化基本表型指標(biāo)是體質(zhì)量[19]。由圖1a 可知，實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，第2 周開始，各組之間出現(xiàn)差異，且差異持續(xù)到實(shí)驗(yàn)?zāi)┢凇ｋS著時(shí)間的推移，每組小鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)增加的趨勢，相比于CK 組，HFD 組小鼠體質(zhì)量增加的速度明顯加快，第6 周時(shí)，HFD 組小鼠體質(zhì)量比CK 組高出21.2%。而低、中、高劑量組PSND 對小鼠體質(zhì)量的增加均有明顯抑制作用，尤其中劑量組的作用效果最顯著。由圖1b 可知，與CK 組相比，HFD 組的體質(zhì)量平均增長量超出159.02%，具有極顯著性差異（P＜0.001）。與HFD 組相比，N 組平均體質(zhì)量增長不存在顯著性差異（P＞0.05），L組、M 組和H 組平均體質(zhì)量增長量均有極顯著性差異（P＜0.001），分別降低31.25%，37.38%和49.13%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明飼喂PSND 能顯著降低肥胖小鼠體質(zhì)量。

圖1 PSND 對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of phytosterol nano-dispersion on body weight in mice

2.2.2 PSND 對小鼠脂肪質(zhì)量和脂肪系數(shù)的影響

在嚙齒動(dòng)物和人類中，白色脂肪組織通過儲(chǔ)存脂肪達(dá)到儲(chǔ)能作用，棕色脂肪組織則是重要的能量代謝器官[20]。由表4 可以看出，與CK 組相比，高脂膳食使得小鼠的白色脂肪（SUB 和EP）質(zhì)量和脂肪系數(shù)極顯著升高（P＜0.001），皮下脂肪和附睪脂肪質(zhì)量分別超過CK 組551.43%和264.41%；棕色脂肪質(zhì)量增加也具有顯著性差異（P＜0.05）。與HFD 組相比：對于SUB，N 組脂肪質(zhì)量和脂肪系數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05），L、M、H 組脂肪重量分別降低19.30%（P＜0.05）、47.37%（P＜0.01）和60.53%（P＜0.01），具有劑量依賴性；L、M、H 組脂肪系數(shù)均顯著下降。對于EP，只有H 組與HFD 組相比脂肪質(zhì)量具有顯著性差異（P＜0.05），降低了26.05%；M、H 組脂肪系數(shù)均顯著下降（P＜0.05）。對于BAT，只有H 組與HFD 組相比脂肪質(zhì)量具有顯著性差異（P＜0.05），降低了62.5%，脂肪系數(shù)均不具有顯著性差異（P＞0.05）。

表4 PSND 對小鼠脂肪重量和脂肪系數(shù)的影響Table 4 Effects of phytosterol nano-dispersion on fat weight and fat coefficient of mice

2.2.3 PSND 對高脂膳食小鼠肝臟的保護(hù)作用如表5所示，與CK 組相比，HFD 組肝臟指數(shù)增加了18.79%（P＜0.05）。肝臟指數(shù)的顯著上升將導(dǎo)致肝臟解毒負(fù)荷的增加[21]。與HFD 組相比，N 組肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05），而不同劑量PSND 的干預(yù)均能降低肝臟指數(shù)，但只有高劑量組具有顯著性差異（P＜0.05）。與CK 組相比，HFD 組血清中AST、ALT 活力顯著增加（AST，P＜0.05；ALT，P＜0.001），表明高脂飲食會(huì)引起肝功能發(fā)生損傷。與HFD 組相比，高劑量PSND 的干預(yù)顯著降低AST 水平（P＜0.05）。對于ALT，與HFD 組相比，中劑量和高劑量PSND 的干預(yù)使血清中ALT 水平分別降低71.96%和71.54%，均具有顯著性差異（P＜0.001）。血清AST、ALT 活力結(jié)果和肝臟指數(shù)存在正相關(guān)性對應(yīng)，表明PSND 的干預(yù)能夠緩解高脂膳食引起的肝功能損傷。

表5 PSND 對小鼠肝功能的影響Table 5 Effects of phytosterol nano-dispersion on liver function in mice

2.3 脂肪組織形態(tài)學(xué)分析

如圖2所示，對于SUB 和EP，CK 組脂肪細(xì)胞排列整齊、分布均勻且大小一致。相比于CK組，HFD 組小鼠脂肪細(xì)胞膨大，大小不均一，顯微鏡相同視野范圍內(nèi)，脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯減少。與HFD 組相比，N 組脂肪細(xì)胞大小和數(shù)量無明顯變化，L 組、M 組和H 組小鼠脂肪細(xì)胞直徑顯著減小，顯微鏡相同視野內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯增加。對于BAT，CK 組小鼠棕色脂肪細(xì)胞大小均一，未見明顯的脂肪空泡。與CK 組相比，HFD 組小鼠棕色脂肪組織內(nèi)脂滴較多，出現(xiàn)較大的脂肪空泡，鏡下視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)目較少，經(jīng)過PSND 干預(yù)后，L 組脂肪空泡的尺寸雖明顯減小，但仍然有較大的脂肪滴，而M 組和H 組效果顯著，視野范圍內(nèi)脂肪滴減少，同時(shí)棕色脂肪細(xì)胞數(shù)量增加?？梢奝SND 對抑制脂肪細(xì)胞的膨大和棕色脂肪白色化具有明顯效果。

圖2 小鼠脂肪組織病理H&E 染色觀察（×200）Fig.2 Pathological H&E staining of mouse adipose tissue（×200）

2.4 PSND 對小鼠血清血脂水平的影響

由表6 可知，高脂膳食使得小鼠血清中的LDL-C 和TC 水平顯著上升（P＜0.01），導(dǎo)致小鼠血脂代謝紊亂，與之前的研究結(jié)果一致[22-23]。然而，高脂膳食對于HDL-C 和TG 水平?jīng)]有顯著影響（P＞0.05）。相比于HFD 組，只有H 組的LDL-C 和TC水平發(fā)生了顯著性的降低（P＜0.05），分別降低了34.55%和19.50%，其它組均無顯著性差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明高劑量PSND 顯著降低肥胖小鼠LDL-C 和TC 水平。

表6 各組小鼠血清血脂水平Table 6 Serum lipid levels of each group mice

2.5 PSND 對膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步深入分析PSND 對調(diào)控膽固醇代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，本研究通過提取各組小鼠肝臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，對HMGCR、LDL-R和CYP7A1的mRNA 相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示。由圖6a 可以看出，與CK 組相比，高脂飲食導(dǎo)致HMGCR表達(dá)量上調(diào)，而PSND 的干預(yù)可以下調(diào)HMGCR基因表達(dá)。由圖6B、6c 所知，與CK 組相比，HFD 組LDL-R和CYP7A1的mRNA 表達(dá)量降低，而PSND 的干預(yù)會(huì)上調(diào)LDL-R和CYP7A1的表達(dá)。

圖3 肝組織基因mRNA 表達(dá)量Fig.3 The expression of mRNA in liver tissue

2.6 PSND 對小鼠血糖的影響

2.6.1 PSND 對小鼠空腹血糖的影響 由圖4 可知，高脂膳食導(dǎo)致小鼠血糖顯著升高（P＜0.01）。與HFD 組相比，N、L、M 和H 組空腹血糖值雖均有降低，但N 和L 組沒有顯著性差異（P＞0.05），M 組和H 組均具有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠空腹血糖水平Fig.4 Fasting blood glucose levels of mice

2.6.2 PSND 對小鼠葡萄糖耐量的影響 葡萄糖作為機(jī)體能量的主要來源，當(dāng)糖代謝出現(xiàn)紊亂時(shí)，機(jī)體攝入一定量的葡萄糖后，血糖將急劇上升，長時(shí)間不能恢復(fù)至空腹水平，稱為糖耐量異常[24]。各組小鼠血糖值隨時(shí)間變化曲線如圖5a所示，計(jì)算注射葡萄糖后120 min 以內(nèi)曲線下面積AUC 來進(jìn)一步評(píng)估各組小鼠的葡萄糖耐量，結(jié)果如圖5b所示。與CK 組相比，HFD 組AUC 極顯著性增加（P＜0.001），表明高脂飲食導(dǎo)致小鼠對血液葡萄糖調(diào)節(jié)能力明顯降低。與HFD 組相比，M 組和H 組AUC 均顯著性降低（P＜0.05），而L 組AUC 值下降不顯著（P＞0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂膳食會(huì)引起小鼠葡萄糖耐量異常，而PSND 對此有所改善。

圖5 PSND 對小鼠葡萄糖耐量的影響Fig.5 Effects of phytosterol nano-dispersion on glucose tolerance in mice

2.6.3 PSND 對小鼠胰島素耐量的影響 由圖6a可以看出，注射胰島素后，各組小鼠血糖水平均持續(xù)下降。與CK 組相比，HFD 組曲線下面積AUC顯著增加（P<0.001）；L 組、M 組、H 組的曲線下面積AUC 均顯著低于HFD 組（P<0.001）（圖6b），分別下降37.19%，47.39%和33.46%。胰島素耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示高脂膳食使小鼠產(chǎn)生一定的胰島素抵抗，而不同劑量PSND 均極顯著提高小鼠胰島素敏感性。

圖6 PSND 對小鼠胰島素耐量的影響Fig.6 Effects of phytosterol nano-dispersion on insulin tolerance in mice

3 討論

自1953年首次報(bào)道植物甾醇具有降低人體膽固醇功效以來，植物甾醇降膽固醇作用被廣泛研究報(bào)道[25-26]，本研究通過制備基于酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物的PSND，對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高劑量（97.9 mg/kg）的PSND 能顯著降低高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠血清中TC 和LDL-C 水平，比植物甾醇酯化成分（839.4 mg/kg）和植物甾醇糖苷化成分（1 106.2 mg/kg）降膽固醇的劑量都要低[27]，并且本實(shí)驗(yàn)制備的酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物所包埋的PSND，可以有效提高植物甾醇的水溶性，從而進(jìn)一步擴(kuò)大植物甾醇在食品加工中的開發(fā)和應(yīng)用?；赑SND顯著降低高脂誘導(dǎo)小鼠的血脂水平，本研究通過測定調(diào)控膽固醇代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從基因?qū)用鎭磉M(jìn)一步分析PSND 降血脂的分子機(jī)理。作為肝細(xì)胞合成膽固醇過程中的限速酶，HMGCR催化β-羥基-β-甲基戊二酸單酰CoA 生成甲羥戊酸[28]，HMGCR 活性越高，合成的膽固醇越多。血液中的LDL 與細(xì)胞膜上的LDL-R 結(jié)合后，內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后被分解而利用[29]，因此LDL-R 在轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇過程中起關(guān)鍵作用。CYP7A1 是膽汁酸主要合成途徑的限速酶[30]，而膽固醇主要去路之一是合成膽汁酸，因此CYP7A1 對調(diào)控血清中膽固醇含量也起到非常關(guān)鍵的作用。上述3 個(gè)參與膽固醇代謝關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的研究結(jié)果表明PSND可能通過抑制HMGCR 酶活力、提高CYP7A1 酶活力及促進(jìn)LDL-R 表達(dá)來改善其對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠血脂水平，這與植物甾醇降脂相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道一致[31-32]。

此外，高脂環(huán)境也是造成高血糖和胰島素抵抗的重要危險(xiǎn)因素[7]。而植物甾醇對降血糖及改善糖尿病方面的功效在相關(guān)文獻(xiàn)中有報(bào)道[7-9，33]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基于酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物所包埋的PSND 可有效改善因高脂飲食造成的血糖含量升高和葡萄糖耐量受損，同時(shí)可以改善胰島素抵抗。這可能是由于脂代謝和糖代謝之間緊密關(guān)聯(lián)，PSND 通過提高脂代謝調(diào)控水平，緩解因高脂膳食造成的血糖代謝異常。而具體準(zhǔn)確的調(diào)控機(jī)理需要進(jìn)一步進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

綜上所述，由于本研究制備的PSND 具有顯著的降血脂和降血糖功效，可進(jìn)一步對其制備工藝進(jìn)行系統(tǒng)研發(fā)，同時(shí)對其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入分析，從而積極促進(jìn)該植物甾醇納米分散系統(tǒng)在高脂膳食干預(yù)方面發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

基于酪蛋白酸鈉-葡聚糖糖基化復(fù)合物的PSND 能顯著降低高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠血脂水平，同時(shí)兼具降血糖和保護(hù)肝臟的功效。本研究為擴(kuò)大植物甾醇在食品中的應(yīng)用和推廣提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。