王娟娟，尹興平，季江

梅毒是一種由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，TP)感染引起的世界范圍內(nèi)流行的性傳播疾病，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。部分梅毒患者經(jīng)規(guī)范治療癥狀得以改善，但血清學(xué)指標(biāo)長(zhǎng)期持續(xù)陽(yáng)性，發(fā)展成為血清固定，部分患者因梅毒螺旋體侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)如腦膜、腦實(shí)質(zhì)、血管或脊髓等發(fā)展為神經(jīng)梅毒。血清固定和神經(jīng)梅毒可發(fā)生于梅毒不同發(fā)展階段，對(duì)患者的身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，具體致病機(jī)制不明，治療手段有限，給臨床醫(yī)生對(duì)于該病的診療造成很大的困惑，故揭示血清固定和神經(jīng)梅毒的發(fā)生機(jī)制對(duì)梅毒有效防治至關(guān)重要。

梅毒螺旋體感染機(jī)體后宿主的免疫反應(yīng)對(duì)梅毒的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。多認(rèn)為機(jī)體清除梅毒螺旋體的機(jī)制主要與宿主的細(xì)胞免疫功能有關(guān)[1]，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)神經(jīng)梅毒和血清固定患者細(xì)胞免疫失衡的研究有限，不同階段神經(jīng)梅毒的細(xì)胞免疫可能存在差異但相關(guān)研究甚少。本研究通過(guò)檢測(cè)血清固定、神經(jīng)梅毒患者以及健康對(duì)照組外周血中的Th1、Th2和Th17類細(xì)胞因子的水平變化，進(jìn)一步分析不同階段神經(jīng)梅毒患者外周血上述細(xì)胞因子水平，研究神經(jīng)梅毒患者不同階段的細(xì)胞免疫狀況、炎癥相關(guān)因子和免疫抑制情況，探討其在神經(jīng)梅毒和血清固定中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院及蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院2017年9月-2021年10月期間收治的神經(jīng)梅毒患者79例，根據(jù)TP侵犯部位和癥狀將神經(jīng)梅毒分為早期(主要損害腦脊膜及血管)和晚期(主要損害腦和脊髓實(shí)質(zhì))[2]。79例患者中，男62例，女17例，平均年齡57.0(19～78)歲。根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)分為三組：無(wú)癥狀神經(jīng)梅毒組6例，早期神經(jīng)梅毒組23例，晚期神經(jīng)梅毒組50例。同時(shí)收集血清固定患者65例，其中男19例，女46例，平均年齡42.4(18～74)歲，對(duì)照組為30例健康體檢者，其中男、女各15例，平均年齡46.4(23～69)歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 神經(jīng)梅毒患者納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：①有神經(jīng)梅毒的臨床表現(xiàn)且腦脊液RPR和TPPA陽(yáng)性；②腦脊液RPR陰性但TPPA陽(yáng)性并滿足無(wú)其他原因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦脊液蛋白升高(≥0.5 g /L)、腦脊液白細(xì)胞升高(≥5×106/L)伴神經(jīng)梅毒典型臨床表現(xiàn)。入組患者外周血TPPA、RPR 陽(yáng)性，且排除了HIV感染和其他病原體感染。

排除神經(jīng)梅毒標(biāo)準(zhǔn)：①血清RPR和TPPA陰性；②血清RPR或TPPA陽(yáng)性，但腦脊液RPR、腦脊液TPPA、腦脊液白細(xì)胞數(shù)和蛋白定量正常，無(wú)神經(jīng)梅毒體征或癥狀。

血清固定診斷標(biāo)準(zhǔn)：梅毒患者經(jīng)過(guò)正規(guī)驅(qū)梅治療后臨床癥狀消失，在排除了生物學(xué)假陽(yáng)性、再感染及神經(jīng)梅毒等其他系統(tǒng)的感染后，其非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)在規(guī)定的隨訪時(shí)間結(jié)束后(早期梅毒2年，晚期梅毒3年)持續(xù)不轉(zhuǎn)陰[4]。

1.3Th1、Th2及Th17類細(xì)胞因子檢查 采集外周血2 mL，以3 000 r/min離心5 min后取血清，按照試劑盒說(shuō)明書，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(試劑盒均購(gòu)于聯(lián)科公司)測(cè)定，在450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(A)值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組外周血中Th1細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)及Th17細(xì)胞因子(TNF、IL-17A)的含量。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)梅毒與血清固定患者外周血中Th1、Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子分析 IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17A在神經(jīng)梅毒、血清固定患者和健康對(duì)照組間血清含量變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-6、IL-10和TNF在3組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步行LSD檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)梅毒患者和血清固定患者IL-2、IFN-γ、IL-4高于對(duì)照組，IL-17A低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。神經(jīng)梅毒與血清固定患者外周血各細(xì)胞因子表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

表1 神經(jīng)梅毒組與血清固定組外周血Th1、Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子分析Tab.1 The levels of Th1,Th2 and Th17 cytokines in neurosyphilis and serofast pg/mL )

圖1 神經(jīng)梅毒與血清固定患者外周血Th1、Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子分析Fig.1 Analysis of Th1, Th2 and Th17 cytokines in peripheral blood of patients with neurosyphilis and serofast

2.2不同階段神經(jīng)梅毒患者外周血中Th1、Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子分析 IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17A在不同階段神經(jīng)梅毒患者及對(duì)照組間的含量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， IL-6、IL-10和TNF在不同臨床階段神經(jīng)梅毒患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；進(jìn)一步行LSD檢驗(yàn)，無(wú)癥狀神經(jīng)梅毒患者IL-2、IFN-γ高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-4、IL-17A在該兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；早期和晚期神經(jīng)梅毒患者IL-2、IFN-γ、IL-4高于對(duì)照組，IL-17A在早期神經(jīng)梅毒與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，晚期神經(jīng)梅毒患者IL-17A低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4組分析結(jié)果見(jiàn)表2。分析不同臨床階段神經(jīng)梅毒與血清固定患者外周血Th1、Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

表2 不同臨床階段神經(jīng)梅毒外周血Th1、Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子分析Tab.2 The levels of Th1, Th2 and Th17 cytokines in neurosyphilis at different clinical pg/mL)

圖2 不同階段神經(jīng)梅毒與血清固定患者外周血Th1、Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子分析Fig.2 Analysis of Th1, Th2 and Th17 cytokines in peripheral blood of patients with serofast and neurosyphilis at different stages

3 討論

梅毒螺旋體感染人體后，免疫反應(yīng)對(duì)梅毒的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。由于梅毒螺旋體不能離開(kāi)哺乳動(dòng)物在其體外存活，也不能進(jìn)行體外培養(yǎng)和遺傳操作(基因插入或敲除)，梅毒發(fā)病機(jī)制的研究受到限制，具體免疫機(jī)制至今尚未完全明確。目前認(rèn)為，細(xì)胞免疫尤其CD4+T淋巴細(xì)胞(即Th細(xì)胞)對(duì)機(jī)體清除梅毒螺旋體有重要作用[2]，Th細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞因子分泌的不同分為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等，通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞因子，以多種分泌方式參與體內(nèi)復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在機(jī)體清除TP過(guò)程中發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)和殺傷作用，對(duì)調(diào)節(jié)保護(hù)性和致病性免疫應(yīng)答極其重要[5]。

梅毒螺旋體感染機(jī)體后，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在一定程度上消除了病原體，隨著病程進(jìn)展，Th1型細(xì)胞因子水平逐漸下降，Th2型應(yīng)答優(yōu)勢(shì)表達(dá)。此過(guò)程中，自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等的吞噬殺傷能力下降，不能完全清除梅毒螺旋體，這種狀態(tài)的持續(xù)，最終影響梅毒預(yù)后。Th17細(xì)胞對(duì)病原體的宿主防御極為重要，是CD4+T淋巴細(xì)胞的一種特殊類型。Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ與Th2細(xì)胞分泌的IL-4能抑制Th17細(xì)胞的分化，Th2細(xì)胞分泌的IL-6可促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[6]。Th1、Th2 、Th17和Treg細(xì)胞存在著微妙的相互調(diào)節(jié)和拮抗的關(guān)系，處于復(fù)雜而精細(xì)的平衡狀態(tài)。細(xì)胞因子作用存在著多效性和重疊性，既有協(xié)同又存在互相拮抗，細(xì)胞炎癥效應(yīng)和Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡相互影響，在梅毒進(jìn)程中起重要作用。

近年來(lái)，隨著潛伏梅毒發(fā)病率不斷上升，梅毒血清固定現(xiàn)象在臨床上愈來(lái)愈受到關(guān)注，血清固定可發(fā)生于梅毒各期(主要是三期和潛伏期)，有資料顯示梅毒患者在早期經(jīng)正規(guī)驅(qū)梅治療仍有15.0%可能發(fā)展成為血清固定，其發(fā)生機(jī)制缺乏一致認(rèn)識(shí)[7]。血清固定與患者感染梅毒螺旋體的病程長(zhǎng)、治療不及時(shí)和不規(guī)范等有關(guān)，危險(xiǎn)因素包括青年、女性、非青霉素治療和低滴度的非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)，近來(lái)研究[8]發(fā)現(xiàn)，血清固定與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，可能涉及的因素包括T細(xì)胞減少、Treg表達(dá)上調(diào)、Treg和Th17細(xì)胞的平衡偏移等。梅毒患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的減少特別是絕對(duì)計(jì)數(shù)水平的降低可能與梅毒患者發(fā)生血清固定有關(guān)[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，梅毒血清固定患者可能同時(shí)存在Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞,Treg細(xì)胞/Th17 細(xì)胞的失衡,從而影響患者體內(nèi)整體免疫應(yīng)答水平。梅毒患者中PD-1水平顯著增高，梅毒感染過(guò)程中可能通過(guò)PD-1影響Th1向Th2轉(zhuǎn)化而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，造成梅毒螺旋體不易被機(jī)體清除而引起血清固定的發(fā)生[11]。另有研究[12]表明，血清固定患者Th細(xì)胞數(shù)目和功能降低，IFN-γ、TNF-α、IL-6和CRP水平顯著低于治療有效的患者，提示機(jī)體存在細(xì)胞免疫抑制。本研究中血清固定患者的IL-2、IFN-γ、IL-4較健康對(duì)照組高，提示血清固定患者免疫功能存在異常，Th1、Th2細(xì)胞因子參與血清固定患者的免疫應(yīng)答。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清固定患者IL-17A較健康對(duì)照組低，這與既往多個(gè)研究結(jié)果相同，提示梅毒血清固定患者存在Treg/Th17失衡，Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答受到抑制。

梅毒螺旋體侵犯腦膜和/或腦實(shí)質(zhì)，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，發(fā)展為神經(jīng)梅毒，梅毒在全球范圍內(nèi)的上升趨勢(shì)預(yù)示著神經(jīng)梅毒發(fā)病率的增加[13]。螺旋體對(duì)于中樞系統(tǒng)的侵入亦可出現(xiàn)在梅毒各期，其被清除的機(jī)制與宿主的免疫功能有關(guān)，與多種細(xì)胞因子有關(guān)[14]。Yan等[15]研究NS患者治療前后CSF和血清Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ)、Th2型細(xì)胞因子(IL-6、IL-10)的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)梅毒患者CSF、血清Th2型細(xì)胞因子濃度升高，而Th1型細(xì)胞因子濃度降低，治療后CSF中IL-6濃度下降，IL-2和IL-12濃度升高，考慮Th1/Th2型細(xì)胞因子可能參與神經(jīng)梅毒患者免疫應(yīng)答，并對(duì)于神經(jīng)梅毒的診斷和療效評(píng)估有一定的作用。近期研究表明，Th17反應(yīng)可能參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損壞以及與有癥狀型神經(jīng)梅毒患者關(guān)聯(lián)。Th17/IL-17可作為替代的標(biāo)志評(píng)估神經(jīng)梅毒患者的療效[16]。

IL-17A主要來(lái)自于Th17，通過(guò)促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的釋放募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[17]。IL-17可以破壞閉鎖蛋白間的緊密連接、激活內(nèi)皮收縮機(jī)制從而提高血腦屏障通透性。TLR和γ干擾素(IFN-γ)受體可以協(xié)同刺激小膠質(zhì)細(xì)胞中一氧化氮合酶表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，提高血腦屏障通透性[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，TP侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，隨著病情的進(jìn)展，腦脊液IL-17升高，且與CSF蛋白水平、VDRL滴度有相關(guān)性，表明IL-17可能參與神經(jīng)梅毒的神經(jīng)損傷。本研究比較神經(jīng)梅毒、血清固定患者與健康對(duì)照組Th17類細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)IL-17A在不同組別間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步比較神經(jīng)梅毒與血清固定患者Th17相關(guān)細(xì)胞因子，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明炎癥反應(yīng)貫穿梅毒進(jìn)程的不同階段。神經(jīng)梅毒組患者IL-17A較健康對(duì)照組低，表明神經(jīng)梅毒患者Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答受到抑制，不能有效清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的梅毒螺旋體導(dǎo)致了病情的遷延。這與Wang等[16]研究相反，該研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)梅毒患者外周血Th17細(xì)胞的頻率顯著增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，各組間IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-17A差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)不同病期神經(jīng)梅毒患者分別與對(duì)照組患者比較，發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀型神經(jīng)梅毒患者IL-2、IFN-γ較對(duì)照組高，IL-4、IL-17A與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示無(wú)癥狀神經(jīng)梅毒患者細(xì)胞免疫表達(dá)增強(qiáng)。早期神經(jīng)梅毒患者IL-2、IFN-γ、IL-4較對(duì)照組高，IL-17A與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明隨病程進(jìn)展，體液免疫增強(qiáng)。晚期神經(jīng)梅毒患者IL-2、IFN-γ、IL-4較對(duì)照組高，IL-17A低于健康對(duì)照組，提示隨著病程延長(zhǎng)，患者體液免疫進(jìn)一步增強(qiáng)，而細(xì)胞免疫受到抑制。不同階段神經(jīng)梅毒與血清固定患者外周血各細(xì)胞因子差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明炎癥反應(yīng)貫穿于梅毒感染的整個(gè)病程。

綜上所述，神經(jīng)梅毒和血清固定患者的Th1、Th2及Th17類細(xì)胞因子存在異常，且神經(jīng)梅毒不同階段之間也存在差異，可能與神經(jīng)梅毒和血清固定的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究后續(xù)將分析外周血與腦脊液細(xì)胞因子的差異以明確該細(xì)胞因子是否為鞘內(nèi)分泌，分析外周血或腦脊液各細(xì)胞因子之間的相關(guān)性以明確各類細(xì)胞因子如何相互調(diào)節(jié)或拮抗。此外，對(duì)于上游調(diào)控細(xì)胞因子物質(zhì)的尋找，有助于更好地闡明神經(jīng)梅毒和血清固定的細(xì)胞免疫機(jī)制，關(guān)于影響神經(jīng)梅毒治療和預(yù)后的細(xì)胞因子的研究，對(duì)在驅(qū)梅治療的同時(shí)是否加用免疫抑制劑有一定的指導(dǎo)意義，且有助于推測(cè)神經(jīng)梅毒和血清固定患者的預(yù)后。