羅邁，彭雪婷，王思佳，劉瑋，顧漢江，陸美，王亞琦，夏育民

結(jié)節(jié)性紅斑(erythema nodosum, EN)是一種發(fā)生于皮下脂肪間隔的慢性炎癥性疾病，好發(fā)于年輕女性，皮損多發(fā)生于下肢，主要表現(xiàn)為對(duì)稱分布的鮮紅色結(jié)節(jié)、斑塊，自覺疼痛和壓痛。結(jié)節(jié)性紅斑可分為特發(fā)型和繼發(fā)型兩大類，大多數(shù)患者為特發(fā)型，病因不明；繼發(fā)型多與真菌感染、惡性腫瘤、妊娠、口服避孕藥相關(guān)[1]。組織病理學(xué)表現(xiàn)為皮下脂肪間隔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、脂肪肉芽腫、小葉間隔受累及毛細(xì)血管增生。結(jié)節(jié)性紅斑發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確[2-3]。

腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)主要由炎癥浸潤(rùn)組織中巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞合成分泌，其唯一受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子14(fibroblast growth factor-inducible 14, Fn14)結(jié)合TWEAK后可激活下游信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用。TWEAK/Fn14在生理?xiàng)l件下低表達(dá)，但在應(yīng)激或者組織損傷時(shí)表達(dá)增加，輕度激活可促進(jìn)組織再生和修復(fù)，過度及持續(xù)激活則會(huì)引起一系列炎癥反應(yīng)。TWEAK和受體Fn14結(jié)合后能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞等增殖、遷移和血管形成，并分泌IL-6、IL-8、調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的活性因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)等促炎因子[4]。本課題組前期研究提出Fn14-TRAF2-TNFR信號(hào)軸觀點(diǎn)：特定炎癥微環(huán)境改變細(xì)胞的TNFR(腫瘤壞死因子受體)表達(dá)譜，免疫細(xì)胞分泌的TWEAK與細(xì)胞跨膜Fn14結(jié)合，通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor associated factor 2,TRAF2)將信號(hào)傳導(dǎo)至TNFR亞型分子，繼而調(diào)控細(xì)胞凋亡(TNFR1高表達(dá))或增殖(TNFR2高表達(dá))[5-6]。迄今為止，TWEAK/Fn14信號(hào)在結(jié)節(jié)性紅斑中的表達(dá)尚無文獻(xiàn)報(bào)道，因此本研究主要檢測(cè)TWEAK/Fn14在結(jié)節(jié)性紅斑患者組織中的表達(dá)水平，研究其在結(jié)節(jié)性紅斑發(fā)病過程中的作用，并為其相關(guān)藥物治療提供方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年6月-2021年10月就診于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院并于皮膚科完善皮膚活檢的結(jié)節(jié)性紅斑患者，其中男5例，女10例，年齡23～50歲。正常對(duì)照組來自皮膚科色素痣切除術(shù)的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床及皮膚病理確診的結(jié)節(jié)性紅斑患者，即臨床表現(xiàn)為下肢對(duì)稱分布、伴有觸痛的紅色皮下結(jié)節(jié)或紅斑，同時(shí)病理表現(xiàn)為小葉間隔受累為主的脂膜炎患者，且患者無其他皮膚病及全身系統(tǒng)性疾病。

1.2主要試劑與儀器 兔抗人Fn14多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體(美國(guó)CST公司)，兔抗人TWEAK多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，Trizol(invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green(Takara)；PCR引物(上海生工生物工程公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)；蛋白垂直電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(德國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取上述皮損組織和正常組織采用Trizol進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄后獲得模板cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織中TWEAK、Fn14基因表達(dá)水平，TWEAK正向引物序列為5′-AGGTGTGGACGGGACAGTGAG-3′，反向引物序列為5′-CCAGCACACCATCCACCAG-3′，F(xiàn)n14正向引物序列為5′-CTCTGAGCCTGACCTTCGTG-3′，反向引物序列為5′-GGGGGCACATTGTCACTGGA-3′，GAPDH正向引物序列為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物序列為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。引物合成于上海生工生物工程公司。

1.3.2蛋白印跡 RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA定量法測(cè)定蛋白濃度，加入5×loading buffer制定蛋白樣品，95 ℃變性5 min，蛋白樣品等質(zhì)量等體積上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入TWEAK、Fn14、β-actin抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后加入對(duì)應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜4次，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)成像并進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色 將切好的石蠟組織載玻片于62 ℃烘烤30～40 min，常規(guī)脫蠟、水化，抗原修復(fù)10 min后自然冷卻至室溫，PBS浸洗，組織表面滴加3%內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育10 min，PBS浸洗5 min，2%BSA封閉，37 ℃孵育30 min，滴加適當(dāng)比例的一抗，4 ℃濕盒過夜。次日滴加DAKO二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)，干燥后中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1皮損組織及正常皮膚組織中TWEAK和Fn14分子mRNA表達(dá)差異比較 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在結(jié)節(jié)性紅斑患者和正常人皮膚組織中TWEAK/Fn14分子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，皮損組織中TWEAK mRNA表達(dá)顯著高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.07，P<0.01)，F(xiàn)n14在皮損組織中有上升趨勢(shì)(t=0.34，P=0.74)，見圖1。

Note: **P<0.01 vs. control group.圖1 TWEAK/Fn14分子在皮膚組織中的mRNA表達(dá)水平Fig.1 The mRNA expression levels of both TWEAK and Fn14 in skin tissue

2.2皮損組織及正常皮膚組織中TWEAK和Fn14蛋白表達(dá)水平 蛋白印跡結(jié)果顯示，結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損組織中TWEAK和Fn14蛋白表達(dá)水平升高，而正常皮膚組織中表達(dá)較低，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用灰度值表示，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TWEAK：t=3.68，P<0.01；Fn14：t=7.67，P<0.000 1)，見圖2。

Note: **P<0.01 vs. control group；****P<0.000 1 vs. control group.圖2a～2c TWEAK/Fn14蛋白在皮膚組織中的蛋白表達(dá)水平Fig.2a～2c The protein expression levels of both TWEAK and Fn14 in skin tissue

2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)TWEAK和Fn14蛋白表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，TWEAK和Fn14蛋白主要在真皮層血管周圍及脂肪小葉間隔表達(dá)，主要定位在細(xì)胞膜，為棕色顆粒沉積；表皮層有少量表達(dá)。正常組織有少量陽性細(xì)胞著色，呈淺棕色，著色程度明顯少于皮損組。TWEAK與Fn14均在結(jié)節(jié)性紅斑患者中表達(dá)高于正常皮膚組織。采用Image J統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)陽性細(xì)胞面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TWEAK：t=4.43，P<0.01；Fn14：t=3.83，P<0.01)，見圖3。

3 討論

結(jié)節(jié)性紅斑是皮膚中最常見的脂膜炎類型，其發(fā)病誘因較多，潛在因素復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前一般認(rèn)為結(jié)節(jié)性紅斑可能是機(jī)體的一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)，也可能是免疫復(fù)合物沉積在相應(yīng)部位所致[1]。臨床上主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、病史、實(shí)驗(yàn)室檢查及組織病理進(jìn)行綜合診斷，有學(xué)者認(rèn)為免疫功能紊亂是其發(fā)病的主要原因[7]。

早期結(jié)節(jié)性紅斑患者伴有血管損傷、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥反應(yīng)會(huì)擴(kuò)散到真皮和小葉脂膜，晚期還伴有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[8]。TWEAK是結(jié)構(gòu)高度保守的Ⅱ型跨膜蛋白，分為可溶性TWEAK和膜結(jié)合性TWEAK，其唯一受體Fn14胞外區(qū)有一富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域可與TWEAK結(jié)合，胞質(zhì)尾部含有TRAF結(jié)合位點(diǎn)。TWEAK主要通過分泌多種促炎因子、黏附分子和趨化因子，如RANTES、γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon gamma-induced protein 10, IP-10)和單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)，進(jìn)而趨化巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與局部炎癥反應(yīng)[9-11]。在生理?xiàng)l件下TWEAK與Fn14的表達(dá)較低，組織損傷后其表達(dá)明顯上調(diào)[12]。課題組前期研究證明，在狼瘡性腎炎患者中，尿和血清中可溶性TWEAK水平升高與患者腎臟疾病活動(dòng)相關(guān)。靶向TWEAK或其他抑制TWEAK/Fn14信號(hào)的中和抗體可減輕狼瘡小鼠模型的腎臟損害程度[9]；TWEAK/Fn14信號(hào)也參與銀屑病的發(fā)展，F(xiàn)n14缺失可改善銀屑病樣病變，并伴隨病變皮膚炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生減少[13-14]。此外，研究[15]表明，TWEAK/Fn14信號(hào)通路在過敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用。TWEAK血清水平在急性期過敏性紫癜患者中升高，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。然而，關(guān)于TWEAK/Fn14信號(hào)軸在結(jié)節(jié)性紅斑中的表達(dá)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白印跡以及免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)皮損組織中TWEAK/Fn14 mRNA水平和蛋白水平變化。結(jié)果表明，與正常皮膚組織相比，結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損處TWEAK和受體Fn14顯著高表達(dá)，主要在真皮層血管周圍及脂肪小葉間隔。以往研究報(bào)道TWEAK/Fn14信號(hào)調(diào)控銀屑病皮損中真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過表達(dá)黏附分子在白細(xì)胞募集中發(fā)揮重要作用。TWEAK/Fn14信號(hào)能刺激內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子如CCL5及炎癥相關(guān)黏附分子，如E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子Ⅰ和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-1的表達(dá)，促進(jìn)血管增生，趨化白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等遷移至炎癥部位，從而加劇炎癥反應(yīng)[4]。因此，推測(cè)TWEAK/Fn14信號(hào)通路的激活與真皮血管中趨化因子、炎癥因子和黏附分子的募集分泌密切相關(guān)。

綜上所述，本研究通過比較結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損組織及正常皮膚組織中TWEAK與Fn14的表達(dá)差異，提示TWEAK/Fn14通路可能在結(jié)節(jié)性紅斑發(fā)病機(jī)制中起重要作用。后續(xù)本課題組會(huì)繼續(xù)測(cè)定TWEAK/Fn14信號(hào)軸下游一系列趨化因子和炎癥因子，擴(kuò)大樣本例數(shù)，進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制，為結(jié)節(jié)性紅斑的臨床治療提供新思路。