付彥博，王 雯，許寶丹，彭蕓花

(1.海南醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，?？?570216; 2.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心，?？?570312；3.海南醫(yī)學(xué)院，海口 571199)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性最常見(jiàn)的生殖內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病，也是生育期女性不孕不育的主要原因，近年其全球患病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。PCOS病因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，臨床癥狀高度異質(zhì)，尚無(wú)明確有效的防治手段，尋找高效靶分子仍是研究熱點(diǎn)。堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALPL)又稱TNAP、TNALP、APTNAP、TNSALP、AP-TNAP、TNS-ALP，位于1號(hào)染色體短臂，參與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，在PCOS中未見(jiàn)研究[2]。本研究利用生物信息技術(shù)有效整合多種數(shù)據(jù)集，圍繞PCOS和ALPL進(jìn)行深度挖掘，并應(yīng)用臨床標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，初探ALPL在PCOS發(fā)生中的作用及其關(guān)鍵基因，為PCOS的靶向研究提供新的研究思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集 選擇2021年11月3日至2022年1月1日在海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的女性患者21例，其中PCOS 11例和非PCOS 10例，符合2003年鹿特丹PCOS國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除因其他原因?qū)е碌呐怕旬惓；蚋咝奂に匾约盁o(wú)嚴(yán)重心、肺、肝等重癥疾病。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HYLL-2021-127)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)集獲取及篩選差異 通過(guò)NCBI的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GENE EXPRESSION OMNIBUS,GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)搜集并獲取本研究所需的PCOS微陣列相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE106724的原始數(shù)據(jù)，其中GSE106724包括8例PCOS患者及4例非PCOS患者，進(jìn)行mRNAs的微陣列篩選。此數(shù)據(jù)集系列矩陣文件和平臺(tái)作為CEL文件下載。數(shù)據(jù)集的差異分析，使用GEO2R在線分析工具進(jìn)行分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，以adj-P<0.05與| logFC|>1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。

1.2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將差異基因DEGs上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，獲得交集靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖和相關(guān)數(shù)據(jù)。將相關(guān)數(shù)據(jù)通過(guò)Cytoscape 3.9.0構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 GO功能及KEGG通路富集分析 利用R4.0.5軟件對(duì)DEGs的交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能分析(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析，并將結(jié)果根據(jù)GeneRatio大小排序。此外，利用“pathview”包繪制GeneRatio值最大的信號(hào)通路圖。

1.2.4 RNA提取及QRT-PCR對(duì)卵泡液中顆粒細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè) 卵泡液經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)篩，使用RNA提取試劑盒(普洛麥格，上海)提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(翊圣生物，上海)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有操作按試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行。使用q225熒光定量PCR儀檢測(cè)基因表達(dá)，反應(yīng)條件按熒光定量 PCR 試劑盒(翊圣生物，上海)操作說(shuō)明進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。各基因及其內(nèi)參的擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR中使用的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 PCOS相關(guān)差異基因篩選 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載 GSE106724 ，去除一個(gè)探針對(duì)應(yīng)多個(gè)分子的探針，遇到對(duì)應(yīng)同一個(gè)分子的探針時(shí)，僅保留信號(hào)值最大的探針。GSE106724包括8例PCOS患者 (PCOS ) 和4例正常(Normal)進(jìn)行mRNAs的微陣列篩選，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并用GEO2R中基于R的Web應(yīng)用進(jìn)行分析，且各個(gè)樣本中位數(shù)基本在一個(gè)水平線，表明樣本間歸一化程度好(圖1)。使用GEO2R在線工具對(duì)GSE106724數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)確定DEGs，adj-P<0.05,|logFC|>1進(jìn)行篩選，使用R語(yǔ)言 (版本3.5.1) 的ggplot2和venndiam包，通過(guò)火山圖繪制DEGs可視化。結(jié)果顯示，PCOS數(shù)據(jù)集GSE106724中共獲得607個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)310個(gè)，下調(diào)297個(gè)(圖2)。

2.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件對(duì)607個(gè)DEGs進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖分析，生成PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，連線表示蛋白質(zhì)之間的相互作用(圖3)。

2.3 對(duì)DEGs進(jìn)行GO、KEGG富集分析 GO功能富集分析包括：細(xì)胞對(duì)干擾素的反應(yīng)(cellular response to interferon-gamma)、趨化因子受體結(jié)合(CCR chemokine receptor binding)、干擾素代謝信號(hào)通路(interferon-gamma-mediated signaling pathway)；MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合體(MHC class Ⅱ protein complex)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分(integral component of lumenal side of endoplasmic reticulum membrane)等，這些生物學(xué)過(guò)程均與離子轉(zhuǎn)運(yùn)和膜蛋白運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)(表2及圖4、5)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些差異基因主要參與了以下信號(hào)通路的調(diào)節(jié)：哮喘(Asthma)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、同種異體移植排斥(Allograft rejection)、I型糖尿病(Type I diabetes mellitus)等(圖6)。

表2 GO功能富集具體信息

通過(guò)對(duì)607個(gè)DEGs進(jìn)行整合分析發(fā)現(xiàn)，ALPL蛋白在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中,與SPP1、FKBP5、AKAP5、LDHAL6A、DLX5蛋白之間存在相互作用，表明ALPL、SPP1、FKBP5、AKAP5、LDHAL6A、DLX5關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。因此，通過(guò)對(duì)圍繞ALPL的差異基因進(jìn)行PPI蛋白互作具體描述(圖7、表3)。

2.4 對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行臨床驗(yàn)證 qRT-PCR法對(duì)PCOS和非PCOS患者顆粒細(xì)胞中關(guān)鍵基因的mRNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALPL mRNA含量在PCOS患者卵泡液中均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SPP1、FKBP5、AKAP5 mRNA含量在PCOS患者卵泡液中均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果與前期綜合得到的數(shù)據(jù)和趨勢(shì)相一致，DLX5、LDHAL6A無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。

3 討 論

PCOS是一種常見(jiàn)內(nèi)分泌疾病，影響約5%～15%的育齡婦女，是生育期女性不孕不育的主要原因，高血壓、早期動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝、抑郁/焦慮等情感障礙性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高，遠(yuǎn)期糖尿病、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌等發(fā)病率明顯增加，嚴(yán)重影響女性身心健康及家庭幸福[4-5]。隨著各種大規(guī)模非腫瘤生物學(xué)數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，生物信息學(xué)的研究方法與策略開始深入到各種疾病研究的各個(gè)層面,并取得了很多振奮人心的科研成果[6]。本研究中，整合GSE106724數(shù)據(jù)集，分析了12個(gè)樣品，其中包括4例正常人卵泡液，8例PCOS患者卵泡液，篩選出與PCOS相關(guān)聯(lián)的607個(gè)差異基因，其中310個(gè)DEGs表達(dá)上調(diào)，297個(gè)DEGs表達(dá)下調(diào)。通過(guò)對(duì)這些DEGs的GO富集分析表明，DEGs主要介入細(xì)胞對(duì)干擾素的反應(yīng)(cellular response to interferon-gamma)、趨化因子受體結(jié)合(CCR chemokine receptor binding)、干擾素代謝信號(hào)通路(interferon-gamma-mediated signaling pathway)；MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合體(MHC class Ⅱ protein complex)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分(integral component of lumenal side of endoplasmic reticulum membrane)等生物學(xué)過(guò)程，而這些生物學(xué)過(guò)程均與離子轉(zhuǎn)運(yùn)和膜蛋白運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)。本研究KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些DEGs主要富集于：哮喘(Asthma)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、同種異體移植排斥(Allograft rejection)、Ⅰ型糖尿病(Type I diabetes mellitus)等。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和cytoscape軟件估計(jì)DEGs之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)以ALPL為中心與SPP1、FKBP5、AKAP5、LDHAL6A、DLX5互作性較強(qiáng)。通過(guò)對(duì)臨床樣品RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，ALPL在PCOS組的表達(dá)低于非PCOS組，SPP1、FKBP5、AKAP5 3個(gè)基因在PCOS組的表達(dá)均高于非PCOS組(P<0.05)，與前期數(shù)據(jù)和趨勢(shì)一致。綜上表明這4個(gè)基因在PCOS中的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。其中ALPL在這幾個(gè)基因中處于中心位置，將其相互關(guān)聯(lián)。

研究表明，非特異性堿性磷酸酶ALPL 基因突變可導(dǎo)致堿性磷酸酶活性偏低，從而引起低堿性磷酸酶酯血癥，其主要臨床表現(xiàn)有佝僂病、肌肉張力減退、癲癇和多發(fā)性骨折等[7]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腦膜瘤中ALPL部分片段表達(dá)缺失，因此 ALPL 被認(rèn)為是腦膜瘤候選抑癌基因[8]。在前列腺癌中，ALPL 表達(dá)增高與更差的生存預(yù)后相關(guān)[9]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雄激素過(guò)多則導(dǎo)致PCOS發(fā)生[10]，高雄激素則是PCOS的主要特征，因此ALPL可能會(huì)作為PCOS的表型指標(biāo)之一。

分泌磷蛋白1 (secreted phosphoprotein 1,SPP1)，又稱骨橋蛋白樣蛋白或早期蛋白T淋巴細(xì)胞活化蛋白1，是一種多功能分泌性酸性糖蛋白[11]。SPP1屬于小整合素結(jié)合配體n -連接糖蛋白家族，主要表現(xiàn)在骨骼和牙齒上。研究發(fā)現(xiàn)，ALPL基因敲除小鼠表現(xiàn)為牙骨質(zhì)缺失，SPP1基因表達(dá)異常[12]。SPP1與乳腺癌惡性程度呈正相關(guān)[13]。最近一項(xiàng)研究表明，SPP1在肺癌中高表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤有關(guān)分期、淋巴結(jié)浸潤(rùn)、腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)[14]。FK506(FK506 binding proteins,FKBPs)是高度保守的伴侶分子蛋白家族，通過(guò)激活組蛋白分子伴侶、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，影響基因表達(dá)、修復(fù)及復(fù)制等，其中結(jié)合蛋白5(FKBP5)是其家族成員之一。研究顯示，F(xiàn)KBP5與某些實(shí)體瘤的發(fā)生有關(guān)，其高表達(dá)可誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞[15]。在人類腫瘤研究中，F(xiàn)KBP5表達(dá)升高或降低均有發(fā)現(xiàn)[16]。目前越來(lái)越多研究顯示，F(xiàn)KBP5可能是腫瘤的新型靶向指標(biāo)[17]。此外，目前發(fā)現(xiàn)AKAPs (A-kinase anchoring protein)是一種結(jié)構(gòu)不同但具有相似功能的蛋白家族，可調(diào)控心臟中鈣離子的變化、心肌肥大、心力衰竭等[18]。AKAP5，也可稱為AKAP79/AKAP150,被證明可與蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)結(jié)合調(diào)控下游蛋白變化，還包括多種關(guān)鍵蛋白，PKC和鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)等信號(hào)分子錨定結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)控心肌細(xì)胞的各種活動(dòng)[19]。AKAP5在心律失常疾病中可調(diào)控鈣離子超載，影響心房心室的信號(hào)傳導(dǎo)，加重心律失常，是鉀離子通道突變引起心律失常的潛在治療靶點(diǎn)[20]。

綜上所述，ALPL、SPP1、FKBP5、AKAP5參與多種腫瘤的發(fā)生，本研究通過(guò)生物信息技術(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，它們也參與PCOS的發(fā)生發(fā)展，卵泡液中mRNA檢測(cè)也驗(yàn)證了這一結(jié)果，其中ALPL位于它們作用的核心部位，可能是PCOS發(fā)生的限速基因，通過(guò)調(diào)控SPP1、FKBP5、AKAP5介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)PCOS的發(fā)生發(fā)展，有望成為PCOS新的靶分子。本研究只是初步發(fā)現(xiàn)，具體作用及機(jī)制需進(jìn)一步研究。