崔耀元，孫朝陽

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦科腫瘤科，武漢 430030)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見且死亡率最高的惡性腫瘤，診斷后5年生存率始終低于40%。卵巢癌的一線治療主要依賴減瘤手術(shù)和鉑類化療，但術(shù)后復(fù)發(fā)和化療耐藥是卵巢癌治療無法回避的困境。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制劑的出現(xiàn)使卵巢癌患者治療方案的選擇產(chǎn)生了革命性變化，特別是對于乳腺癌易感基因蛋白1和2(breast cancer susceptibility gene 1/2,BRCA1/2)突變的腫瘤，PARP抑制劑顯著延長了患者的無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)[1]。

PARP家族，特別是PARP-1和PARP-2，是DNA單鏈斷裂(single-strand break,SSB)修復(fù)途徑的關(guān)鍵組成部分。PARP抑制劑引起單鏈斷裂并不斷積累轉(zhuǎn)化為雙鏈斷裂(double strand break,DSB)，這些DNA損傷在BRCA1/2突變導(dǎo)致的同源重組修復(fù)缺陷(homologous recombination repair defective,HRD)腫瘤中無法修復(fù)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即“合成致死性(synthetic lethality)”[2]。盡管PARP抑制劑已在部分卵巢癌患者治療中取得了成功，幾乎不可避免的耐藥性的出現(xiàn)，限制了該藥治療持續(xù)時間和患者獲益程度。

適應(yīng)性反應(yīng)是指腫瘤細(xì)胞和腫瘤生態(tài)系統(tǒng)在面對發(fā)育和更新過程中發(fā)生的應(yīng)激，或由于環(huán)境干擾時，迅速實(shí)施內(nèi)源性應(yīng)激緩解策略，直至其產(chǎn)生基因組或表觀基因組改變從而獲得抵抗性[3]。本文重點(diǎn)關(guān)注了PARP抑制劑治療卵巢癌引起的適應(yīng)性反應(yīng)，這種反應(yīng)發(fā)生迅速，且具有高度的可逆性和針對性，為阻止或逆轉(zhuǎn)耐藥的出現(xiàn)提供了新的靶向干預(yù)的機(jī)會。

1 腫瘤細(xì)胞固有適應(yīng)性反應(yīng)

1.1 信號通路的擾動 信號通路影響腫瘤生長、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等廣泛的細(xì)胞活動，信號通路具有高度可塑性，細(xì)胞能通過重新激活或繞過靶分子快速適應(yīng)應(yīng)激得以存活[4]。蛋白質(zhì)是生物過程的基本功能單位，PARP抑制劑適應(yīng)性反應(yīng)主要發(fā)生在蛋白質(zhì)水平，包括與功能密切相關(guān)的翻譯后修飾(post-translationally modification,PTM)。反向蛋白組學(xué)(reverse-phase protein arrays,RPPA)是一種基于抗體抗原結(jié)合的高通量、半定量、收益高的功能蛋白組學(xué)研究方法[5]。

本課題組前期利用RPPA平臺，對多種PARP抑制劑(olaparib,niraparib,BMN673)處理多種腫瘤細(xì)胞(卵巢癌、內(nèi)膜癌、乳腺癌細(xì)胞)，在2D單層細(xì)胞培養(yǎng)、3D細(xì)胞培養(yǎng)、類器官(patient-derived organoid,PDO)培養(yǎng)條件下處理不同時間點(diǎn)(3d，7d)后進(jìn)行了高通量的RPPA組學(xué)檢測的研究，首次全面探索了腫瘤在應(yīng)對PARP抑制劑壓力下產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)。本課題組及Labrie等研究發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑顯著激活了PI3K/AKT/mTOR通路，包括pGSK3β、pmTOR、p70S6K及其下游靶點(diǎn)pS6_pS235_S236、pS6_pS240_S244[6-7]。通過阻斷激活通路來減少適應(yīng)性反應(yīng)造成的腫瘤細(xì)胞存活是研究PARP抑制劑適應(yīng)性反應(yīng)的目的之一， Konstantinopoulos等證明了PI3K抑制劑(alpelisib)和PARP抑制劑(olaparib)的協(xié)同作用支持了靶向適應(yīng)性激活通路是有效的這一概念[8]。

此外，PARP抑制劑誘導(dǎo)叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3a(forkhead box O 3a,FOXO3a)、p27和Bim意外減少，而pBRAF、pMEK、pMAPK、pPKC和pYB1適度增加，表明存在Ras/Raf/MAPK通路激活[6]。基于此發(fā)現(xiàn)，本課題組在一組卵巢癌細(xì)胞系中評估了PARP抑制劑與MEK抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效果，聯(lián)合療法在多種卵巢癌細(xì)胞系和體內(nèi)模型中顯示出協(xié)同作用，特別是在KRAS突變腫瘤中[9]。在臨床前證據(jù)的支持下，本課題組啟動了一項(xiàng)名為SOLAR的臨床試驗(yàn)(NCT03162627)，測試MEK抑制劑(selumetinib)和PARP抑制劑(olaparib)在子宮內(nèi)膜、卵巢和其他具有Ras通路改變的實(shí)體瘤以及難以治療PARP抑制劑耐藥卵巢癌中的聯(lián)合應(yīng)用。

1.2 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)生的有序和協(xié)調(diào)的細(xì)胞死亡過程，是主動的程序性死亡，對機(jī)體自穩(wěn)調(diào)節(jié)有著重要意義 。B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)蛋白家族分為促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bad、Bcl-Xs、Bid、Bik和Bim)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bfl-1和Mcl-1) ，深度參與線粒體促凋亡分子(如細(xì)胞色素C)釋放等凋亡途徑[10]。本課題組發(fā)現(xiàn)，PARP抑制劑誘導(dǎo)凋亡功能介質(zhì)的失衡，促凋亡蛋白Bax和Bid上調(diào)，Bim顯著降低，抑凋亡蛋白BCL-XL上調(diào)[6]。Lui等[11]證明PARP抑制劑(rucaparib)與Bcl2抑制劑(CPI-203和CPI-0610)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面有良好的協(xié)同作用。

1.3 代謝應(yīng)激 腫瘤代謝重編程已成為對藥物誘導(dǎo)應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分，這可能揭示癌細(xì)胞的新的治療可能性[12]。PARP家族以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)為供體，催化單ADP核糖單元(mono ADP-ribose,MAR)或多ADP核糖體單元(poly ADP-ribose,PAR)以靶向蛋白質(zhì)；該過程也分別稱為MAR?；騊AR酰化[13]。Bajrami等[14]在三陰性乳腺癌中觀察到煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,NAMPT)抑制劑減弱了PARP抑制所誘導(dǎo)的腫瘤NAD+水平的增加，并且聯(lián)合療法進(jìn)一步抑制了腫瘤的增殖，表明PARP抑制劑與NAD+消耗性藥物的聯(lián)合具有潛在的治療益處。

Tang等[15]發(fā)現(xiàn)，PARP抑制劑可增加腺苷5-單磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5-monophoshate-activated protein kinase,AMPK)磷酸化激活，AMPK是由低ATP和高AMP水平(即高AMP/ATP比率)激活的細(xì)胞能量傳感器，可通過磷酸化下游底物3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase,ACC)使其失活從而抑制膽固醇和脂肪酸合成[16]。

1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 作為真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)主要發(fā)揮運(yùn)輸和整合蛋白質(zhì)、協(xié)助蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸、脂質(zhì)生物合成和維持鈣穩(wěn)態(tài)等功能。一旦缺氧、代謝應(yīng)激或錯誤折疊蛋白質(zhì)等破壞機(jī)體穩(wěn)態(tài)，真核細(xì)胞將通過一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)適應(yīng)性途徑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙做出快速反應(yīng)[17]。Bahar等[18]發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulated protein,GRP78)、鈣結(jié)合伴侶凝集素(calnexin)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)蛋白表達(dá)。

2 腫瘤免疫微環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)

腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment,TIME)主要成分包括免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和血管，調(diào)控腫瘤發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移[19]。腫瘤的發(fā)展伴隨著癌細(xì)胞和TIME之間多種復(fù)雜的相互作用，腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)環(huán)境及其相互作用均受靶向治療影響，并對腫瘤進(jìn)展有重要影響。

2.1 免疫細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng) 多項(xiàng)研究表明，PARP家族在免疫細(xì)胞中發(fā)揮一定作用。PARP1/2調(diào)節(jié)幾種常見的炎癥因子和細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和白細(xì)胞介素1-β(interleukin 1-β,IL1-β)[20]。Shen等發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑誘導(dǎo)胞質(zhì)雙鏈DNA(double stranded DNA,dsDNA)積累，進(jìn)一步激活環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)/ 膜蛋白干擾素刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)/ TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)/ 干擾素調(diào)節(jié)因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)先天免疫途徑，誘導(dǎo)I型干擾素(interferon,IFN)及其相關(guān)免疫反應(yīng)，無論實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠裼蠦RCA1/2突變[21]。然而，Jiao等發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑通過糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)失活來上調(diào)程序性死亡受體-配體1(PD ligand 1,PD-L1)的表達(dá)，使癌細(xì)胞對T細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷更有抵抗力進(jìn)而造成免疫微環(huán)境的免疫抑制[22]。基于PARP抑制劑上調(diào)PD-L1表達(dá)，Lampert等證明PARP抑制劑(olaparib)與PD-L1抑制劑(durvalumab)聯(lián)合療法在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中有一定的臨床療效[23]?？傊?，PARP抑制劑對免疫微環(huán)境的影響復(fù)雜而微妙，需在多種模型和臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

2.2 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng) 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)是基質(zhì)的主要組成部分，分泌生長因子、炎癥配體和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促進(jìn)腫瘤的增殖、抗治療和免疫排斥[24]。Martincuks等[25]在PARP抑制劑治療后的卵巢癌患者的腫瘤活檢中，發(fā)現(xiàn)CAF中轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)激活增加。高水平的STAT3與晚期卵巢癌和不良預(yù)后相關(guān)，STAT3在卵巢癌患者CAF中的上調(diào)可能通過促進(jìn)治療抗性和免疫抑制來促進(jìn)疾病的進(jìn)展。Kettner等[26]證明了PARP抑制劑(olaparib)和STAT3抑制劑(napabucasin/TTI-101)聯(lián)合顯著增加了帕博西尼(palbociclib)耐藥的乳腺癌細(xì)胞的死亡。此外，Linares等[27]發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑通過抑制轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(transcription factor activator protein-1,AP-1)、c-FOS和c-JUN的PAR化，引起p62下調(diào)，導(dǎo)致CAF激活從而成為腫瘤進(jìn)展的催化劑，這表明抑制CAF活性的藥物與PARP抑制劑的聯(lián)合療法可能帶來臨床受益。

2.3 血管生成的適應(yīng)性反應(yīng) 血管生成是新血管形成的過程，在正常的卵巢生理學(xué)以及卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用，是一個由血管生成激活因子(如VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β)和抑制因子(如Angs、TSP-1)共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程[28]。PARP-1的過表達(dá)通過直接或間接調(diào)節(jié)VEGF-A的表達(dá)和分泌，進(jìn)而在上皮性卵巢癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌中發(fā)揮了促血管生成作用[29]。Bizzaro等[30]在一組卵巢癌PDX模型中證明了在臨床相關(guān)劑量下使用PARP抑制劑(olaparib)和VEGFR抑制劑(cediranib)治療表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，且不依賴于HR狀態(tài) 。

3 展望

卵巢癌靶向治療的耐藥性是一個重要挑戰(zhàn)，為了延長靶向藥的反應(yīng)時間和改善患者預(yù)后，了解腫瘤和腫瘤免疫微環(huán)境在治療壓力下的變化是極其必要的。適應(yīng)性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜，機(jī)體在內(nèi)外應(yīng)激源誘導(dǎo)下，產(chǎn)生多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化、代謝應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及通過腫瘤和腫瘤免疫微環(huán)境的復(fù)雜相互作用，最大限度發(fā)揮自身抵抗能力獲得耐藥性。卵巢癌患者在接受PARP抑制劑治療1～2周即可檢測到PARP抑制劑引起的適應(yīng)性反應(yīng)，且不同患者治療后樣本保持了部分相似的適應(yīng)性反應(yīng)[7]?；趯m應(yīng)性反應(yīng)的客觀分析，靶向適應(yīng)性反應(yīng)開發(fā)合理聯(lián)合用藥方案是對抗PARP抑制劑耐藥的一大利器，不僅可進(jìn)一步抑制腫瘤發(fā)展，同時可能延緩耐藥性克隆的出現(xiàn)，為改善臨床患者預(yù)后提供機(jī)會。目前多種PARP抑制劑聯(lián)合其他小分子抑制劑的療法通常具有一定的協(xié)同效果，但常因?yàn)槭艿蕉拘韵拗贫鵁o法真正應(yīng)用于臨床。我們應(yīng)采取靈敏而精準(zhǔn)的工具，如RPPA，判斷某治療階段治療壓力引起的特征性變化，通過聯(lián)合療法、序貫療法等符合腫瘤適應(yīng)性反應(yīng)的方式來實(shí)現(xiàn)個體化精準(zhǔn)而安全治療的目的。

4 總結(jié)

綜上所述，卵巢癌診斷時間晚、復(fù)發(fā)率高，是病死率最高的婦科惡性腫瘤。PARP抑制劑使BRCA1/2突變卵巢癌患者的預(yù)后大為改善，但仍面對靶向藥物耐藥的通病。PARP抑制劑治療卵巢癌后會引起腫瘤和腫瘤免疫微環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)，如何利用適應(yīng)性反應(yīng)針對性開展聯(lián)合療法，可能是延緩或逆轉(zhuǎn)PARP抑制劑耐藥的有效手段。