高秀娟，莊新榮，張雅麗，張桂香

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，承德 067000)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是常見的婦科惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高[1]。目前晚期OC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療是細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療[2]。然而，盡管手術(shù)和化學(xué)治療取得了進(jìn)展，但晚期OC患者的5年生存率僅為35%～40%，這主要是由于順鉑(cisplatin，DDP)耐藥的發(fā)展[3]。因此，研究DDP耐藥相關(guān)的分子機(jī)制具有重要意義。

微小RNA(microRNAs，miRNA)是由20～25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA分子，通過與靶基因結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的生長、凋亡和遷移[4]。miR-107是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，如miR-107可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性[5]，miR-107可逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性[6]。據(jù)報(bào)道，miR-107表達(dá)在OC患者和細(xì)胞系中顯著降低，其過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，抑制OC細(xì)胞增殖，在OC中充當(dāng)腫瘤抑制因子[7-8]。生物鐘循環(huán)輸出蛋白(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK)為DDP耐藥基因，在多藥耐藥中發(fā)揮重要作用[9]。研究顯示，沉默DDP耐藥OC細(xì)胞中的CLOCK后，DDP處理能顯著抑制DDP耐藥OC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。另有報(bào)道稱，miR-107是一種調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律系統(tǒng)的miRNA，CLOCK為miR-107的靶基因，miR-107與CLOCK基因結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞晝夜節(jié)律失調(diào)[11]。然而，miR-107可否通過CLOCK調(diào)節(jié)OC細(xì)胞對DDP的敏感性仍有待研究。

大量研究表明,環(huán)狀RNA (circular RNA,circRNA)影響癌癥進(jìn)展[12-13]。circRNAs調(diào)控腫瘤進(jìn)展的主要方式是充當(dāng)miRNAs的海綿，進(jìn)而進(jìn)一步調(diào)控下游mRNAs表達(dá)[12]。CircWHSC1是一種新型circRNA，來源于WHSC1基因的外顯子反向剪接，在多種癌癥的發(fā)展中發(fā)揮致癌作用。據(jù)報(bào)道，CircWHSC1在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與宮頸癌患者的存活率呈負(fù)相關(guān)[14]。高表達(dá)circWHSC1的三陰性乳腺癌患者預(yù)后較差，CircWHSC1沉默可減少三陰性乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長，并在體外抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15]。最近研究顯示，CircWHSC1在OC中被上調(diào)，充當(dāng)致癌基因[16]，CircWHSC1過表達(dá)可加劇OC細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[13]，但具體機(jī)制尚不完全清楚。生物信息分析顯示，CircWHSC1與miR-107存在結(jié)合位點(diǎn)。CircWHSC1能否通過調(diào)控miR-107/CLOCK軸影響OC細(xì)胞增殖、凋亡和DDP耐藥性尚不明確。因此，本研究主要探究CircWHSC1對OC細(xì)胞增殖、凋亡和DDP耐藥性的影響及其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80、卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、HO-8910、A2780及卵巢癌DDP耐藥株SKOV3/DDP均購自上海烜雅生物公司。

1.2 主要試劑 CircWHSC1小干擾RNA(si-CircWHSC1)及其陰性對照(si-NC)、miR-107模擬物(miR-107 mimic)及其陰性對照(mimic NC)、miR-107抑制物(miR-107 inhibitor)及其陰性對照(inhibitor NC)均購自上海艾博思生物公司；MTT試劑盒購自上海歌凡生物公司；Annexin V-FITC/PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海富雨生物公司；兔源一抗CLOCK、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(caspase-3)、多藥耐藥基因(multidrug resistance gene，MDR1)、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將IOSE80、SKOV3、HO-8910、A2780、SKOV3/DDP細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.3.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中CircWHSC1、miR-107表達(dá) 使用TRIzol試劑提取細(xì)胞中總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。U6、GAPDH分別作為miR-107、CircWHSC1的內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法測定基因的相對表達(dá)量。引物序列：GAPDH正向5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；CircWHSC1正向5'-CGATGTTAAGCGTCCGGG-3'，反向5'-GGAAAGATGATGCGCTGTGT-3'；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-107正向5'-AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3'，反向5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建CircWHSC1野生型質(zhì)粒(CircWHSC1-WT)和突變型質(zhì)粒(CircWHSC1-MUT)，將CircWHSC1-WT和CircWHSC1-MUT分別與mimic NC或miR-107mimic共轉(zhuǎn)染于SKOV3細(xì)胞，48h后檢測熒光素酶活性。構(gòu)建CLOCK野生型質(zhì)粒(CLOCK-WT)和突變型質(zhì)粒(CLOCK-MUT)，將CLOCK-WT和CLOCK-MUT分別與mimic NC或miR-107mimic共轉(zhuǎn)染于SKOV3細(xì)胞，48h后評估熒光素酶活性變化。

1.3.4 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，將si-NC、si-CircWHSC1、mimic NC、miR-107 mimic、si-CircWHSC1+inhibitor NC、si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor分別轉(zhuǎn)染于SKOV3細(xì)胞，命名為si-NC組、si-CircWHSC1組、mimic NC組、miR-107 mimic組、si-CircWHSC1+inhibitor NC組、si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組。另取正常培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞作為Ct組，轉(zhuǎn)染48h后用于檢測SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡的變化。

取對數(shù)生長期SKOV3/DDP細(xì)胞，將si-NC、si-CircWHSC1、mimic NC、miR-107 mimic、si-CircWHSC1+inhibitor NC、si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor分別轉(zhuǎn)染于SKOV3/DDP細(xì)胞48h，加2μg/mL DDP處理24h，命名為DDP+si-NC組、DDP+si-CircWHSC1組、DDP+mimic NC組、DDP+miR-107 mimic組、DDP+si-CircWHSC1+inhibitor NC組、DDP+si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組。另取僅用2μg/mL DDP處理24h的SKOV3/DDP細(xì)胞作為DDP組，用于檢測SKOV3/DDP細(xì)胞DDP耐藥性變化。

1.3.5 MTT法檢測DDP IC50及細(xì)胞活力 將SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞分別按5×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，分別用1、2、4、8、16、32μg/mL DDP處理24h，每孔中加15μL MTT試劑，孵育4h，棄培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測490nm處的OD值，計(jì)算細(xì)胞活力和DDP IC50值。細(xì)胞活力(%)=DDP處理細(xì)胞OD490nm/對照細(xì)胞OD490nm×100%。

將各組細(xì)胞按5×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，孵育48h，每孔中加15μL MTT試劑，培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測490nm處的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-DDP處理的細(xì)胞OD490nm/對照細(xì)胞OD490nm)×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將1 × 105個(gè)細(xì)胞懸浮在100μL結(jié)合緩沖液，加5μL FITC Annexin V 和 5μL PI，室溫孵育15min，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7 Western blot法檢測CLOCK、PCNA、Bax、Caspase-3、MDR1蛋白表達(dá) 用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，將總蛋白經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將膜與一抗CLOCK(1∶2000)、PCNA(1∶2000)、Bax(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、MDR1(1∶2000)、GAPDH(1∶2000)4℃過夜孵育，再與二抗(1∶3000)室溫孵育2h。使用ECL試劑觀察蛋白質(zhì)顯色情況，并使用Quantity-One軟件量化蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 CircWHSC1、miR-107、CLOCK蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)以及細(xì)胞對DDP敏感性的檢測 與IOSE80細(xì)胞比較，SKOV3、HO-8910、A2780細(xì)胞中CircWHSC1、CLOCK蛋白表達(dá)升高，miR-107表達(dá)降低(P<0.05)，且SKOV3細(xì)胞中CircWHSC1、CLOCK蛋白表達(dá)量最高，miR-107表達(dá)量最低，因此，選SKOV3細(xì)胞為研究對象。見圖1和表1。MTT檢測結(jié)果顯示，與SKOV3細(xì)胞比較，SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50明顯升高[(28.41±2.05)μg/mL vs(6.75±0.46)μg/mL,P<0.05]，見圖2。與SKOV3細(xì)胞比較，SKOV3/DDP細(xì)胞中CircWHSC1、CLOCK蛋白表達(dá)升高，miR-107表達(dá)降低(P<0.05)，見圖1和表1。提示CircWHSC1、miR-107、CLOCK可能與卵巢癌DDP耐藥相關(guān)。

圖1 Western blot法檢測細(xì)胞中CLOCK蛋白表達(dá)

表1 CircWHSC1、miR-107、CLOCK蛋白在>細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 CircWHSC1靶向調(diào)控miR-107/CLOCK軸 starbase預(yù)測CircWHSC1與miR-107、miR-107與CLOCK的結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。與mimic NC和WHSC1-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-107 mimic和WHSC1-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低(P<0.05)；與mimic NC和WHSC1-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-107 mimic和WHSC1-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。與mimic NC和CLOCK-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-107 mimic和CLOCK-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低(P<0.05)；與mimic NC和CLOCK-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-107 mimic和CLOCK-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。提示CircWHSC1可能通過靶向miR-107調(diào)控CLOCK表達(dá)。

圖2 DDP對SKOV3細(xì)胞和SKOV3/DDP細(xì)胞活力的影響

圖3 starbase預(yù)測CircWHSC1與miR-107、miR-107與CLOCK的結(jié)合位點(diǎn)A：starbase預(yù)測CircWHSC1與miR-107的結(jié)合位點(diǎn)；B：starbase預(yù)測miR-107與CLOCK的結(jié)合位點(diǎn)

表2 熒光素酶活性比較

2.3 沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107對SKOV3細(xì)胞中CircWHSC1、miR-107、CLOCK蛋白表達(dá)的影響 與Ct組、si-NC組比較，si-CircWHSC1組CircWHSC1、CLOCK蛋白表達(dá)降低，miR-107表達(dá)升高(P<0.05)；與Ct組、mimic NC組比較，miR-107 mimic組CircWHSC1表達(dá)變化差異不顯著(P>0.05)，CLOCK蛋白表達(dá)降低，miR-107表達(dá)升高(P<0.05)；與si-CircWHSC1組、si-CircWHSC1+inhibitor NC組比較，si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組CircWHSC1表達(dá)量變化差異不顯著(P>0.05)，miR-107表達(dá)降低，CLOCK蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖4和圖5。結(jié)果提示沉默CircWHSC1可上調(diào)miR-107表達(dá)，抑制CLOCK表達(dá)。

圖4 Western blot檢測SKOV3細(xì)胞中CLOCK蛋白表達(dá)1:Ct組；2:si-NC組；3:si-CircWHSC1組；4:mimic NC組；5:miR-107 mimic組；6:si-CircWHSC1+inhibitor NC組；7:si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組

2.4 沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107對SKOV3細(xì)胞活力、凋亡的影響 與Ct組、si-NC組比較，si-CircWHSC1組SKOV3細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與Ct組、mimic NC組比較，miR-107 mimic組SKOV3細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與si-CircWHSC1組、si-CircWHSC1+inhibitor NC組比較，si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組SKOV3細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，見圖6。結(jié)果提示沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107可降低SKOV3細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖5 CircWHSC1、miR-107、CLOCK蛋白在SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)

圖6 沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107對SKOV3細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率的影響A：細(xì)胞增殖抑制率；B：細(xì)胞凋亡;1:Ct組；2:si-NC組；3:si-CircWHSC1組；4:mimic NC組；5:miR-107 mimic組；6:si-CircWHSC1+inhibitor NC組；7:si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組;*P<0.05 vs Ct組；#P<0.05 vs si-NC組； &P<0.05 vs mimic NC組；@P<0.05 vs si-CircWHSC1組；ΔP<0.05 vs si-CircWHSC1+inhibitor NC組；n=6

2.5 沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107對SKOV3細(xì)胞中增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Ct組、si-NC組比較，si-CircWHSC1組SKOV3細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)降低，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與Ct組、mimic NC組比較，miR-107 mimic組SKOV3細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)降低，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與si-CircWHSC1組、si-CircWHSC1+inhibitor NC組比較，si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組SKOV3細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)升高，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖7。結(jié)果提示沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107可降低SKOV3細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)，升高Bax、caspase-3蛋白表達(dá)。

圖7 Western blot檢測SKOV3細(xì)胞中PCNA、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)1:Ct組；2:si-NC組；3:si-CircWHSC1組；4:mimic NC組；5:miR-107 mimic組；6:si-CircWHSC1+inhibitor NC組；7:si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組;*P<0.05 vs Ct組；#P<0.05 vs si-NC組； &P<0.05 vs mimic NC組；@P<0.05 vs si-CircWHSC1組；ΔP<0.05 vs si-CircWHSC1+inhibitor NC組；n=6

2.6 沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107對SKOV3/DDP細(xì)胞DDP耐藥性的影響 與DDP組、DDP+si-NC組比較，DDP+si-CircWHSC1組SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與DDP組、DDP+mimic NC組比較，DDP+miR-107 mimic組SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與DDP+si-CircWHSC1組、DDP+si-CircWHSC1+inhibitor NC組比較，DDP+si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，見圖8。結(jié)果提示沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107可降低SKOV3/DDP細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)SKOV3/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性。

圖8 沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107對SKOV3/DDP

2.7 沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107對SKOV3/DDP細(xì)胞中CircWHSC1、miR-107、CLOCK蛋白、MDR1蛋白表達(dá)的影響 與DDP組、DDP+si-NC組比較，DDP+si-CircWHSC1組CircWHSC1、CLOCK蛋白、MDR1蛋白表達(dá)降低，miR-107表達(dá)升高(P<0.05)；與DDP組、DDP+mimic NC組比較，DDP+miR-107 mimic組CircWHSC1表達(dá)變化差異不顯著(P>0.05)，CLOCK、MDR1蛋白表達(dá)降低，miR-107表達(dá)升高(P<0.05)；與DDP+si-CircWHSC1組、DDP+si-CircWHSC1+inhibitor NC組比較，DDP+si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組CircWHSC1表達(dá)量變化差異不顯著(P>0.05)，miR-107表達(dá)降低，CLOCK、MDR1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖9、10。結(jié)果提示沉默CircWHSC1或過表達(dá)miR-107可降低SKOV3/DDP中CLOCK、MDR1蛋白表達(dá)，增強(qiáng)SKOV3/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性。

圖9 CircWHSC1、miR-107、CLOCK蛋白、MDR1蛋白在SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)A、B：qRT-PCR檢測細(xì)胞中CircWHSC1、miR-107表達(dá)；C、D：Western blot檢測細(xì)胞中CLOCK、MDR1蛋白表達(dá);1:DDP組；2:DDP+si-NC組；3:DDP+si-CircWHSC1組；4:DDP+mimic NC組；5:DDP+miR-107 mimic組；6:DDP+si-CircWHSC1+inhibitor NC組；7:DDP+si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor組;*P<0.05 vs DDP組；#P<0.05 vs DDP+si-NC組；&P<0.05 vs DDP+mimic NC組；@P<0.05 vs DDP+si-CircWHSC1組；ΔP<0.05 vs DDP+si-CircWHSC1+inhibitor NC組；n=6

圖10 Western blot檢測SKOV3/DDP細(xì)胞

3 討 論

多數(shù)OC患者確診時(shí)已為晚期，盡管腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是有效的治療選擇，但OC很少能治愈，最終由于獲得性耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。研究表明，CircRNA在OC治療中發(fā)揮重要作用[17]。一些CircRNA與OC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為以及DDP耐藥性有關(guān)，但僅在其中少數(shù)CircRNA中闡明了相應(yīng)的分子機(jī)制。

CircWHSC1是一種新發(fā)現(xiàn)的circRNA。據(jù)報(bào)道，CircWHSC1過表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞凋亡[18]；circWHSC1在乳腺癌組織中上調(diào)，過表達(dá)circWHSC1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[19]。表明circWHSC1在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等腫瘤中可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。OC中CircWHSC1呈高表達(dá)[16]，且在中、低分化OC組織中的表達(dá)高于高分化OC組織，過表達(dá)circWHSC1可促進(jìn)OC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，沉默circWHSC1則產(chǎn)生相反效果[13]。關(guān)于CircWHSC1對腫瘤細(xì)胞DDP耐藥性的影響尚未見報(bào)道。本研究顯示，CircWHSC1在OC細(xì)胞SKOV3、HO-8910、A2780中高表達(dá)，且SKOV3細(xì)胞中CircWHSC1表達(dá)量最高，降低SKOV3細(xì)胞中CircWHSC1表達(dá)后，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率增加，這與以往研究結(jié)果[13]一致。因此，選擇SKOV3細(xì)胞為研究對象。本研究發(fā)現(xiàn)，SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50及CircWHSC1表達(dá)明顯高于SKOV3細(xì)胞，沉默CircWHSC1可降低SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥性。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示，沉默CircWHSC1可抑制SKOV3細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)，促進(jìn)SKOV3細(xì)胞中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)，并抑制SKOV3/DDP細(xì)胞中MDR1蛋白表達(dá)，再次證實(shí)沉默CircWHSC1抑制SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，降低DDP耐藥性。

CircRNA可通過海綿化miRNA調(diào)控腫瘤進(jìn)展。本研究通過starbase網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)CircWHSC1與miR-107存在結(jié)合位點(diǎn)。研究表明，miR-107 在OC患者組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，過表達(dá)miR-107可抑制OC細(xì)胞增殖[8]；過表達(dá)miR-107促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞對DDP的敏感性[20]，表明上調(diào)miR-107可抑制OC、喉鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為以及增強(qiáng)細(xì)胞對DDP的敏感性。這與本研究結(jié)果一致， miR-107在SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中低表達(dá)，且miR-107在SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量明顯低于SKOV3細(xì)胞，上調(diào)miR-107可抑制SKOV3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并降低了SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥性。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了CircWHSC1與miR-107存在靶向調(diào)控關(guān)系，且沉默CircWHSC1可上調(diào)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中miR-107表達(dá)，推測沉默CircWHSC1可能通過上調(diào)miR-107表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞對DDP的耐藥性。為了驗(yàn)證該推測，本研究在沉默CircWHSC1基礎(chǔ)上用miR-107 inhibitor干預(yù)SKOV3或SKOV3/DDP細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-107 inhibitor減弱了沉默CircWHSC1對SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡以及DDP耐藥性的影響，表明CircWHSC1可能通過上調(diào)miR-107參與卵巢癌的惡性生物學(xué)行為。

miRNA主要通過負(fù)向下調(diào)基因表達(dá)來調(diào)節(jié)基因功能。為了進(jìn)一步探究CircWHSC1/miR-107軸對SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡以及DDP耐藥性影響的分子機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-107可靶向結(jié)合CLOCK。CLOCK為核心生物節(jié)律基因，可調(diào)控細(xì)胞周期[21]。據(jù)報(bào)道，CLOCK在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[22]。本研究顯示，CLOCK蛋白在SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，且CLOCK蛋白在SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于SKOV3細(xì)胞，沉默CircWHSC1后，SKOV3或SKOV3/DDP細(xì)胞中miR-107表達(dá)上調(diào)，CLOCK表達(dá)下調(diào)；過表達(dá)miR-107后，SKOV3或SKOV3/DDP細(xì)胞中CLOCK表達(dá)降低；miR-107 inhibitor減弱了沉默CircWHSC1對SKOV3或SKOV3/DDP細(xì)胞中CLOCK蛋白表達(dá)的抑制作用，且雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-107靶向調(diào)控CLOCK表達(dá)，表明沉默CircWHSC1可能通過海綿化miR-107下調(diào)CLOCK表達(dá)，進(jìn)而抑制SKOV3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞對DDP的耐藥性。

綜上所述，沉默CircWHSC1可能通過海綿化miR-107下調(diào)CLOCK表達(dá)，進(jìn)而抑制SKOV3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞對DDP的耐藥性。CircWHSC1/miR-107/CLOCK軸可能成為治療OC的新靶點(diǎn)。