金 杰，張 鋒，孫 蓓，王秀杰，趙功寶

（1. 江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校，江蘇 徐州 221116；2. 徐州工業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇 徐州 221140）

荷葉被稱為蓮葉，是中國傳統(tǒng)的中藥材之一，具有減肥、減少脂肪、抗氧化、抗纖維化[1-2]等效果。在中藥上的荷葉常常以干制的形式出現(xiàn)。在古代荷葉就已經(jīng)流入中國，《醫(yī)林纂要》就有記載，荷葉入肝，可平熱，去濕，除妄熱[3-4]。在浙江和遼寧出土的碳化蓮子[5]均可表明古人就已經(jīng)開始對荷葉蓮子有所涉獵，可見其歷史悠久?，F(xiàn)在，湖南、江蘇、安徽都是產(chǎn)荷葉的大省。雖然歷史悠久，但是目前市面上關于荷葉的產(chǎn)品少之又少，少數(shù)用于中醫(yī)藥研究，大多數(shù)無人采摘，造成了很大的浪費。目前，荷葉大多被運用于中醫(yī)藥行業(yè)，而對食品方面的研究進展少之又少，高附加值的產(chǎn)品研發(fā)還處于初始階段。

乳酸菌飲料是以奶粉（牛奶）、果汁（梨、西瓜、獼猴桃、草莓等）、蔬菜汁為主要原料，發(fā)酵發(fā)酵劑制成的產(chǎn)品[6-9]。隨著人們生活水平的提高，消費者的健康意識增強，對牛奶飲料的營養(yǎng)、味道等特點的認識越來越高，牛奶飲料的消費需求也增加了。通過大量相關資料的調查，目前，對以荷葉為原料的產(chǎn)品研發(fā)類型很少[10-12]，只有干制荷葉在市面上出現(xiàn)的較多?，F(xiàn)有研究證明，荷葉浸提液含有大量生物活性物質[1]，保健功能較高，應用價值較好。試驗以發(fā)酵型酸奶為原料，以荷葉浸提液為復配液制備條件，研制活菌型乳酸菌飲料。研究中將具有生物活性的荷葉浸提液與凝固型酸奶相結合，做出一款口感風味極好、營養(yǎng)價值極高的活菌型乳酸菌飲料，進一步豐富發(fā)酵乳飲料的產(chǎn)品種類，滿足社會不同人群的需求，同時提高荷葉在食品中的利用率，具有較好的經(jīng)濟效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料、原料及試劑

伊利全脂乳粉、同仁堂荷葉茶、安琪酸奶發(fā)酵劑，均購自京東商城；發(fā)酵乳，實驗室自制；檸檬酸（食品級）、白砂糖（食品級），浙江一諾科技公司提供；黃原膠（食品級），河南萬邦公司提供。

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、氯化鈉、乙醇、溴甲酚綠指示劑、甲基紅指示劑、亞甲基藍指示劑、MC培養(yǎng)基以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

FA1004 型電子天平，天馬衡基儀器制造有限公司產(chǎn)品；LDZX-30KA 型立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；JM-L50；膠體磨，溫州市一州機械有限公司產(chǎn)品；VS-840-U 型超凈工作臺，江蘇益愷實驗裝備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 荷葉汁風味發(fā)酵乳飲料加工基本工藝流程

乳粉復原→預熱→加糖→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→后熟→破乳→混合→均質→灌裝→冷卻→成品。 ↑

水料水、黃原膠、荷葉汁、白砂糖、食鹽

1.3.2 試驗方案設計

根據(jù)試驗技術路線，荷葉風味發(fā)酵乳飲料分別進行了單因素試驗和響應面試驗，在單因素試驗基礎上，以檸檬酸添加量、白砂糖添加量、水與酸奶液料比和食鹽添加量4 個變量為影響因素，感官評分為響應值，根據(jù)Box-behnken 試驗設計原理進行四因素三水平組合試驗[13-16]。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

1.3.3 荷葉汁發(fā)酵乳飲料感官評分標準

根據(jù)NY/T 898—2016 綠色食品含乳飲料文件為標準[17]，并結合荷葉風味發(fā)酵乳飲料感官評分標準，隨機給9 位經(jīng)驗者提供發(fā)酵乳飲料并進行感官評價，最后計算合計分數(shù)，最終獲得9 人的平均分。

荷葉風味乳飲料感官評價標準見表2。

表2 荷葉風味乳飲料感官評價標準

1.3.4 荷葉汁發(fā)酵乳飲料主要指標檢驗方法

（1） 感官指標檢驗方法。將適量樣品放入50 mL的燒杯中，在自然光下觀察結構和顏色，聞味道，用溫水漱口，品嘗味道，每次品嘗4~10 mL。

（2） 理化指標檢驗方法。①蛋白質指標按照GB 5009.5—2016 凱氏定氮進行測定[18]；②酸度指標按照GB 5009.239—2016 食品安全國家標準 食品酸度的測定進行[19]。

（3） 微生物指標檢驗方法。乳酸菌指標按照GB 4789.35—2016 食品微生物學檢驗進行測定[20]。

2 結果與分析

2.1 荷葉汁發(fā)酵乳飲料配制指南優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 料液比單因素試驗

取600 mL 荷葉汁，向其中添加0.15%的檸檬酸，0.15%的黃原膠，8%的白砂糖和0.12%的食鹽，混勻，待冷卻。將酸奶和復配的料液比以1∶6，1∶5，1∶4，1∶3，1∶2 比例進行復配。

料液比單因素試驗見圖1。

圖1 料液比單因素試驗

由圖1 可知，隨著酸奶料液比的增加，荷葉發(fā)酵乳飲料的感官評價先增加后降低，當料液比達到1∶4 時獲得最高點。當水量較少時，酸奶口味較濃，荷葉味寡淡，故評分較低；隨著酸奶和荷葉汁復配液的比例持續(xù)增加時，其得到感官評價下降了。因為當水量過多時，荷葉味較苦澀且味道比較濃，影響了感官評分。所以酸奶與水的料液比選擇為1∶4時口感風味和組織狀態(tài)最佳。

2.1.2 檸檬酸對荷葉風味乳飲料的影響

試驗取600 mL 的荷葉汁，在其中添加0.15%的黃原膠，8%的白砂糖和0.12%的食鹽充分攪拌混勻。酸奶與復配好的荷葉汁（荷葉汁、白砂糖、黃原膠）比為1 ∶4，分別選用了添加量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%的檸檬酸，研究檸檬酸對荷葉發(fā)酵乳飲料品質的影響。

檸檬酸對荷葉風味發(fā)酵乳飲料的影響見圖2。

由圖2 可知，荷葉發(fā)酵乳飲料的感官評價根據(jù)檸檬酸添加量的增加而不同，當達到0.15%時，得分最高。因為檸檬酸添加量過低時，入口甜而后苦，酸甜比比例失調；當檸檬酸添加過多時，入口酸而后轉為澀，甜味較少，口感不佳，所以當檸檬酸添加量選擇為0.15%時口感風味最佳。

圖2 檸檬酸對荷葉風味發(fā)酵乳飲料的影響

2.1.3 二次添加白砂糖對荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響

二次添加白砂糖，可以改善荷葉汁發(fā)酵乳飲料的味道與口感。因此試驗取600 mL 荷葉汁，向其中加入0.15%的檸檬酸，0.15 的黃原膠和0.12%的食鹽，酸奶與水的料液比為1∶4，再選擇不同白砂糖添加量6%，7%，8%，9%，10%，研究不同白砂糖添加量對荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響。

二次添加白砂糖對荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響見圖3。

圖3 二次添加白砂糖對荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響

由圖3 可知，荷葉風味發(fā)酵乳飲料的感官評分隨著白砂糖添加量的增加而變化，其感官評分從低升高，當達到8%時評分最高，因為二次添加白砂糖減少了荷葉中的苦味。評分逐漸降低，是因為當白砂糖添加過多時，白砂糖掩蓋了乳酸味，使得飲品過于甜，故評分較低，因此試驗選擇白砂糖添加量為8%。

2.1.4 食鹽添加量對荷葉汁發(fā)酵乳飲料品質的影響

食鹽可以有效減少荷葉中的苦澀感，適量的添加可以將口味達到最好，因此試驗取荷葉汁600 mL向其中添加0.15%檸檬酸，0.15%的黃原膠，8%的白砂糖和酸奶與水料比為1∶4，選擇食鹽添加量分別為0.04%，0.08%，0.12%，0.16%，0.20%進行試驗。

食鹽對荷葉風味發(fā)酵乳飲料的影響見圖4。

由圖4 可知，荷葉風味發(fā)酵乳飲料的感官評分根據(jù)食鹽添加量的增加而變化，當達到0.08%時，得分最高。因為食鹽添加量過低時，荷葉中的苦澀感并沒有完全消除，或多或少可以嘗出苦澀感；而食鹽添加過多時，食鹽的咸味占據(jù)了飲料中絕大多數(shù)的滋味。所以，食鹽添加量過高時會影響梨果汁發(fā)酵乳飲料的口感，所以食鹽添加量選擇為0.08%時口感風味最佳。

圖4 食鹽對荷葉風味發(fā)酵乳飲料的影響

2.2 響應面試驗設計結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計結果

在單因素試驗基礎上，以檸檬酸添加量、白砂糖添加量、水與酸奶液料比和食鹽添加量4 個變量為影響因素，感官評分為響應值，根據(jù)Box-behnken試驗設計原理，采用四因素三水平的響應面分析法，對荷葉風味發(fā)酵乳飲料工藝參數(shù)[21]進行優(yōu)化。

Box-behnken 設計方案及響應值見表3。

表3 Box-behnken 設計方案及響應值

應用Design Expert 8.0.6 軟件將表3 中的試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，得到了4 個因素與感官評分之間的回歸方程如下：

為了更好地驗證方程的有效性，對得出的數(shù)據(jù)模型進行了方差分析。

回歸方程的方差分析見表4。

由表4 可知，模型的p<0.01，表現(xiàn)為極顯著水平。失擬項p=0.243 2，表現(xiàn)為不顯著，說明回歸模型與實際情況吻合度高，試驗誤差小，因此可采用此模型對試驗結果進行預測。模型中D、CD、B2、C2、D2的p值均小于0.01，有極顯著的水平，對感官評價得分有極顯著的影響。根據(jù)表4 中的數(shù)據(jù)可得出，在所選取的水平因素范圍內(nèi)，根據(jù)F值的大小，各因素對感官評分影響的程度順序為檸檬酸添加量（D） >料液比（C） >白砂糖添加量（B） >食鹽添加量（A）。

表4 回歸方程的方差分析

2.2.2 響應面圖形分析

通過Design Expert 8.0.6 軟件對回歸模型的分析，可以得到當2 個因素為零水平時，其他2 個因素的交互作用對響應值的影響效果。

食鹽添加量和白砂糖添加量對提取率影響的響應面及等高線見圖5，食鹽添加量和料液比對提取率影響的響應面及等高線見圖6，食鹽添加量和檸檬酸添加量對提取率影響的響應面及等高線見圖7，白砂糖添加量和料液比對提取率影響的響應面及等高線見圖8，白砂糖添加量和檸檬酸添加量對提取率影響的響應面及等高線見圖9，料液比和檸檬酸添加量對提取率影響的響應面及等高線見圖10。

圖5 食鹽添加量和白砂糖添加量對提取率影響的響應面及等高線

圖6 食鹽添加量和料液比對提取率影響的響應面及等高線

圖7 食鹽添加量和檸檬酸添加量對提取率影響的響應面及等高線

圖8 白砂糖添加量和料液比對提取率影響的響應面及等高線

圖9 白砂糖添加量和檸檬酸添加量對提取率影響的響應面及等高線

由等高線可以看出，橢圓形的表示兩兩交互作用顯著，而圓形則相反，響應面的坡度變化反映出各因素變化時，對響應值的變化情況。由圖5 ~ 圖10 可知，檸檬酸添加量對產(chǎn)品感官評分影響最大。

圖10 料液比和檸檬酸添加量對提取率影響的響應面及等高線

2.2.3 配方參數(shù)優(yōu)化

根據(jù)響應面優(yōu)化分析得到荷葉汁發(fā)酵乳飲料的最佳配方為檸檬酸添加量0.048%，白砂糖添加量7.64%，料液比1∶4，食鹽添加量0.19%，感官評價理論值93.07，根據(jù)實際操作的可行性，最佳配方修正為，食鹽添加量為0.20%，白砂糖添加量8%，檸檬酸添加量0.04%，料液比1∶4，為檢驗模型預測的準確性，采用以上工藝配方做3 次平行試驗并進行感官評價，經(jīng)過試驗驗證，此條件下制作的荷葉汁發(fā)酵乳飲料的感官評分為93.07±0.03 分，接近預測值93.37 分，說明響應面分析法對優(yōu)化荷葉汁發(fā)酵乳飲料的工藝條件是可行的。

2.3 優(yōu)化工藝的荷葉汁發(fā)酵乳飲料的指標測定

參照含乳飲料產(chǎn)品標準，將試驗最優(yōu)條件下得到的荷葉風味發(fā)酵乳飲料成品的主要指標進行檢驗，評價產(chǎn)品質量。

荷葉汁發(fā)酵乳飲料產(chǎn)品檢驗結果與標準對照見表5。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法優(yōu)化荷葉汁發(fā)酵乳飲料的制作工藝，得出最佳工藝條件為檸檬酸添加量0.04%，白砂糖添加量8%，料液比1∶4，食鹽添加量0.20%，黃原膠添加量0.15%，此時感官評分最高為93.07 分。4 個因素對荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響順序為檸檬酸添加量（D） >料液比（C） >白砂糖添加量（B） >食鹽添加量（A）。按此配方生產(chǎn)的荷葉汁乳飲料顏色為淺黃色，色澤均勻、味道醇厚，具有荷葉清香味和奶香味，其主要檢驗指標均達到相關標準要求，為進一步市場化開發(fā)奠定了較好的研究基礎。