王偉東,滕 蔓,鄭鹿平,劉金玲,張文凱,4,李林燕,4,張志會,樊劍鳴,羅 俊,4
(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室,河南 鄭州 450002;2.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,河南 鄭州 450001;3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中英禽病國際研究中心,河南 鄭州 450002;4.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院,河南 洛陽 471003)
馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)是一類具有細胞結(jié)合性和嗜淋巴細胞特性的α皰疹病毒,感染宿主雞可誘發(fā)馬立克?。∕arek’s disease,MD),該病以淋巴細胞增生和內(nèi)臟腫瘤形成為主要特征[1]。自1907 年該病首次報道[2]后,目前世界范圍內(nèi)均存在MD 的流行,每年給全球家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。盡管早期使用疫苗免疫雛雞來防控MD 取得了較好的成效,但隨著MDV 毒力的增強,部分流行毒株的毒力突破了現(xiàn)有MD 疫苗的免疫保護,使得MD疫情仍時有暴發(fā)[4-8]。
MicroRNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA 分子,長度22~24 nt。自從LEE等[9]首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)lin-4 后,越來越多的miRNA 在動物、植物以及病毒中被發(fā)現(xiàn)[10]。這些小分子RNA 在細胞的發(fā)育與分化、疾病發(fā)生、腫瘤形成等生物學(xué)過程發(fā)揮重要的調(diào)控功能[11-12]。目前已鑒定出500 多個病毒miRNA,其中絕大多數(shù)編碼于各種人類或動物皰疹病毒基因組中[13]。作為α 皰疹病毒家族的重要成員,血清1 型MDV(MDV-1)編碼14 個miRNA 前體基因,可表達加工生成26 個成熟體miRNA,在MDV基因組反轉(zhuǎn)重復(fù)序列區(qū)中共形成3 個基因簇,即Meq 基因簇、Mid 基因簇和LAT 基因簇[14-15]。雖然少數(shù)幾個病毒miRNA 已被證明參與調(diào)控MDV 的基因表達、腫瘤發(fā)生或潛伏感染[16-25],但大部分MDV miRNA的潛在功能和分子調(diào)控機制仍不清楚。
基于成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列(Cluster regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)和CRISPR 相關(guān)蛋白9(Cas9)系統(tǒng)的基因編輯技術(shù),自2013年首次應(yīng)用于哺乳動物真核細胞基因編輯以來,因其設(shè)計簡單、成本低、效率高而被廣泛應(yīng)用于多種生物學(xué)研究領(lǐng)域。在病毒學(xué)領(lǐng)域尤其是皰疹病毒的基因功能及疫苗研究中,該技術(shù)也已展現(xiàn)出巨大的技術(shù)優(yōu)勢[26-28]。隨著CRISPR/Cas9 系統(tǒng)首次應(yīng)用于改造MDV 基因組以來,國內(nèi)外學(xué)者通過該系統(tǒng)成功構(gòu)建了一系列MDV蛋白質(zhì)編碼基因(如meq、pp38、gB)和miRNA 基因編輯缺失毒株[29-34],為深入研究MDV 的基因功能和致病機制提供了新的技術(shù)支撐。鑒于此,以MDV國內(nèi)分離株HN302 為研究對象,利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建HN302 的miR-M11 前體基因缺失毒株,探究miR-M11 缺失后對MDV 體外復(fù)制能力的影響,旨在為MDV 編碼的miRNA 的調(diào)控功能及分子機制研究奠定基礎(chǔ)。
雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)由9~10日齡SPF雞胚制備;MDV 毒株HN302[7]以及pMD18T-gB/meq/OVO質(zhì)粒為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室保存;pX459 v2.0 基因編輯質(zhì)粒、鼠源抗MDV-pp38 單克隆抗體和兔源抗MDV-Meq 多克隆抗體由英國Pirbright 研究所Venugopal Nair教授饋贈;鼠源抗MDV-gB 單克隆抗體由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授饋贈。
M199、Opti-MEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司;10×Annealing Buffer 購自北京索萊寶科技有限公司;TransIT-X2?Dynamic Delivery System 購自Mirus Bio公 司;TIANamp Genomic DNA Kit 和TIANgel Midi Purification Kit 購自TIANGEN 公司;E.Z.N.A?Endofree Plasmid Mini Kit Ⅱ購自O(shè)mega Bio-Tek 公司;2×Easy Taq?PCR SuperMix、Trans1-T1 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物公司;T4 連接酶和BbsⅠ-HF酶購自NEB 公司;DyLight 488/594 羊抗鼠/兔IgG 購自Abbkine 公司;pMD-18T 載 體、PrimeScript?RT Master Mix 購 自TaKaRa 公 司;FastStart Universal SYBR Green?Master(ROX)購 自Roche 公 司;TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Probe、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ、TaqMan?MicroRNA Assays購自Thermo Fisher公司。
1.3.1 gRNA 及PCR 引物設(shè)計與合成 利用Benchling(https://www.benchling.com)在線設(shè)計軟件,分別設(shè)計靶向Mid 基因簇miR-M11 莖環(huán)結(jié)構(gòu)及其鄰近序列的gRNA,其中非G開頭的gRNA oligo序列在其5′端加上額外的1 個G,并在序列5′端添加BbsⅠ的酶切位點(表1),gRNA 靶點見圖1。利用Premier Primer 5.0 軟件設(shè)計聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和實時熒光定量PCR(qPCR)引物,基因序列見表1,均由生工生物工程(上海)股份有限公司(上海生工)合成。
表1 靶向miR-M11的gRNA及用于鑒定miR-M11缺失株的PCR引物序列Tab.1 gRNA targeting miR-M11 and PCR primer sequences for identification of miR-M11-deleted viruses
圖1 MDV編碼Mid基因簇miRNA的基因座位及gRNA靶點Fig.1 Genomic location encoding MDV miR-M11 in the Mid-cluster and target sites of gRNAs
1.3.2 pX459-gRNA 質(zhì)粒的構(gòu)建 使用BbsⅠ-HF酶切pX459 v2.0 質(zhì)粒并膠回收載體。使用10×Annealing Buffer 將表1 中的gRNA 互補雙鏈進行復(fù)性,利用T4 DNA 連接酶將其連接到pX459 v2.0 載體中,轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細胞,涂布LB 平板,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落。用Step2-F/Step2-R 引物對進行菌液PCR 鑒定后,送上海生工測序。鑒定連接成功后提取pX459-gRNA質(zhì)粒,測定濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 基因編輯效果鑒定 提前準備好24 孔細胞板CEF 單 層,依 據(jù)TransIT-X2?Dynamic Delivery System 使用說明,將靶向miR-M11 莖環(huán)結(jié)構(gòu)上下游的pX459-gRNA 表達質(zhì)粒各250 ng 共轉(zhuǎn)染至CEF后,培養(yǎng)24 h。隨后將HN302病毒按1 000 pfu/孔感染轉(zhuǎn)染后的CEF,48 h后取50%細胞培養(yǎng)物,將其用1×DNA 提取緩沖液(200 μg/mL 蛋白酶K、10 mmol/L Tris-HCl,pH 值8.0、1 mmol/L EDTA、25 mmol/L NaCl)重懸,置于金屬浴中65 ℃30 min、95 ℃5 min后獲得細胞培養(yǎng)物總DNA。以其為模板,用Mid-F/Mid-R進行PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,對目的條帶切膠回收后連接pMD-18T載體,并送上海生工測序。
1.3.4 病毒純化及鑒定 將1.3.3 中轉(zhuǎn)染接毒后的24孔細胞板內(nèi)剩余50%的CEF重懸,用有限稀釋法接種至6孔細胞板CEF 單層。培養(yǎng)3~4 d,觀察到明顯的病毒噬斑后,顯微鏡下無菌操作挑取單克隆病毒噬斑,分別轉(zhuǎn)接至24孔細胞板CEF單層中。繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后,按照1.3.3 中所述方法進行PCR 鑒定。選取編輯產(chǎn)物電泳條帶較亮的孔,進行下一輪噬斑純化。3 輪病毒噬斑純化后,獲得miR-M11 編輯缺失的毒株HN302ΔM11。將其連續(xù)傳代15 次,取第1—5 代、第10 代、第15 代病毒樣品,提取DNA 后進行PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳分析,鑒定基因缺失毒株的穩(wěn)定性。
1.3.5 間接免疫熒光試驗(IFA)從液氮中取出HN302親本毒株和miR-M11缺失毒株HN302ΔM11,分別將其轉(zhuǎn)接至24 孔細胞板CEF 單層內(nèi)。3 d 后,用預(yù)冷的甲醇∶丙酮(1∶1,250 μL/孔)固定;室溫固定10 min 后,用含0.05%Tween-20 的PBS(PBST)洗滌3 遍,甩干;加入含5%脫脂奶粉的PBST,放于37 ℃溫箱中封閉。封閉30 min 后,用PBST 洗3 遍,甩干;加入稀釋的MDV-pp38 鼠源單克隆抗體(1∶5 000,200 μL/孔),放于37 ℃溫箱中孵育。孵育30 min 后,用PBST 洗3 遍,甩干,加入稀釋的熒光二抗DyLight 488 羊抗鼠IgG(1∶1 000,200 μL/孔),放于37 ℃溫箱中孵育。孵育30 min 后,用PBST 洗3遍,甩干。隨后,再按照以上步驟孵育稀釋的MDV-gB 鼠源單克隆抗體(1∶5 000)和稀釋的熒光二抗DyLight 594 羊抗鼠IgG(1∶1 000)。PBST 洗3遍后,每孔加入200 μL PBST,放于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
同時,另取一孔平行接毒的細胞,按照上述操作步驟孵育MDV-Meq 兔源多克隆抗體(1∶5 000)、熒光二抗DyLight 488羊抗兔IgG(1∶1 000)、MDV-gB鼠源單克隆抗體(1∶5 000)和熒光二抗DyLight 594羊抗鼠IgG(1∶1 000)。最后用PBST 洗3 遍,每孔加入200 μL PBST,放于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
1.3.6 qPCR 從液氮中取出HN302 親本毒株和
miR-M11 缺失毒株HN302ΔM11,分別將其轉(zhuǎn)接至6孔細胞板CEF 單層內(nèi),3 d 后收取細胞培養(yǎng)物,用TRIzol 法提取細胞培養(yǎng)物總RNA。使用PrimeScript?RT Master Mix 制備cDNA,以此cDNA為模板,使用表1 中熒光定量引物進行qPCR,檢測病 毒 蛋 白 編 碼 基 因gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a和ICP4的相對表達水平。以總RNA 為模板,使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和MDV miRNA 反轉(zhuǎn)錄引物制備病毒miRNA 的cDNA,使用購自Thermo Fisher 公司的MDV TaqMan探針檢測miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p 和miR-M13-3p 等6 個病毒miRNA的相對表達水平。
1.3.7 病毒增殖曲線繪制 從液氮中取出HN302
親本毒株和miR-M11 缺失毒株HN302ΔM11,轉(zhuǎn)接至6 孔細胞板CEF 單層內(nèi),500 pfu/孔。病毒感染后,每間隔24 h收取1個孔內(nèi)的全部細胞培養(yǎng)物(約106個細胞),至病毒感染后144 h 共收集6 次樣品。用TIANamp Genomic DNA Kit 提取上述樣品DNA,測定DNA 質(zhì)量濃度后稀釋為50 ng/μL,備用。同時,將pMD18T-meq、pMD18T-gB和pMD18T-OVO質(zhì)粒10 倍倍比稀釋后(108拷貝/μL~103拷貝/μL),構(gòu)建qPCR 標準曲線。取上述病毒感染細胞的DNA樣品,使用表1 中列示的熒光定量引物進行qPCR,分別測定2 個毒株在不同時間點gB、meq和OVO的基因拷貝數(shù),并繪制病毒體外增殖曲線。
根據(jù)MDV-1編碼的Mid基因簇miRNA基因座位及序列(圖1),針對miR-M11 前體基因設(shè)計2 條gRNA,通過破壞miR-M11的莖環(huán)結(jié)構(gòu)實現(xiàn)miRNA基因敲除的目的。將gRNA上下游互補雙鏈gR1F/gR1R和gR2F/gR2R分別復(fù)性后與pX459 v2.0載體連接并進行測序。序列比對分析的結(jié)果表明(圖2),成功構(gòu)建了2 個靶向miR-M11 的gRNA/Cas9 表達質(zhì)粒:pX459-gR1和pX459-gR2。
圖2 pX459-gRNA重組質(zhì)粒gRNA連接區(qū)域測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of the gRNA junction region of pX459-gRNA recombinant plasmids
通過pX459-gRNA 轉(zhuǎn)染細胞+病毒感染的方式,將2 個gRNA 表達質(zhì)粒各250 ng 共轉(zhuǎn)染至24 孔細胞板CEF 單層內(nèi),24 h 后感染HN302,病毒感染48 h 后檢測基因編輯效果。結(jié)果顯示,感染病毒的陰性對照僅擴增出1 135 bp 的大條帶,而轉(zhuǎn)染了pX459-gR1/gR2 質(zhì)粒組合并感染HN302 的CEF 中除了擴增出1 135 bp 的大條帶之外,還均擴增出841 bp 大小的與預(yù)期相符的基因編輯小條帶(圖3A)。膠回收目的小條帶,測序結(jié)果顯示,該基因片段確為miR-M11 被編輯剪切后的剩余序列,表明gR1 和gR2 有效編輯了病毒基因組。其中g(shù)R1 的切割位點為PAM 序列上游4 bp 處,而gR2 切割位點位于PAM 序列上游3 bp 處,與預(yù)期完全相符(圖3B、圖3C)。
圖3 miR-M11基因編輯及缺失毒株HN302ΔM11的PCR鑒定及測序分析Fig.3 PCR identification and sequencing analysis of the miR-M11 gene editing and the mutant HN302ΔM11
將1.3.3中剩余的50%病毒感染細胞,以不同劑量梯度轉(zhuǎn)接至6孔細胞板內(nèi),3~4 d后置于倒置顯微鏡下操作,挑取96 個單克隆病毒噬斑至24 孔細胞板不同孔CEF 中,培養(yǎng)48 h 后再次消化取樣進行PCR 鑒定,選取編輯條帶較亮的陽性孔,如上所述進行第2 輪和第3 輪的病毒單噬斑純化,各隨機挑取48 個和24 個單噬斑,最終獲得1 株純化的miRM11 基因編輯缺失毒株,命名為HN302ΔM11(克隆號C58-8-4)。再次測序鑒定的結(jié)果與之前相一致(圖3B、3C)。將HN302ΔM11 連續(xù)傳代15 次,然后分別取樣進行基因編輯穩(wěn)定性分析,PCR 擴增鑒定的結(jié)果顯示,第1—5、10、15 代樣品中均只擴增出841 bp大小的基因編輯小條帶(圖3D),表明基因缺失毒株HN302ΔM11的穩(wěn)定性良好。
為分析Mid 基因簇miR-M11 的缺失是否影響其他 miRNA以及病毒蛋白編碼基因的表達,用HN302 和HN302ΔM11 分別感染CEF,3 d 后收取細胞培養(yǎng)物,提取總RNA 后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TaqMan 探針法檢測Mid 基因簇中miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p 和miR-M13-3p 的相對表達水平。使用SYBR Green 法檢測gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a和ICP4的相對表達水平。以miR-M13-3p 為內(nèi)參分析的結(jié)果顯示,親本株HN302 的miRNA 均可正常表達,而HN302ΔM11 的miR-M11-5p 和miR-M11-3p 均未檢測到表達,其余miRNA 均可表達(圖4)。以ICP4為內(nèi)參基因分析的qPCR 結(jié)果顯示,HN302ΔM11 和親本株的gB、meq、pp38、RLORF4和RLORF5a均正常表達(圖 5)。
圖4 HN302和HN302ΔM11感染CEF中部分病毒miRNA的相對表達水平Fig.4 Relative expression levels of MDV miRNAs in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs
圖5 HN302和HN302ΔM11感染CEF中部分病毒蛋白編碼基因的相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of MDV protein-coding genes in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs
為分析miR-M11 的缺失是否影響MDV 噬斑形成及病毒蛋白的表達,用特異性抗MDV gB、pp38和Meq 蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體分別孵育HN302 和HN302ΔM11 感染的CEF 細胞,進行IFA染色。結(jié)果顯示,在熒光顯微鏡下,HN302 和HN302ΔM11 的綠色熒光染色的pp38 蛋白或Meq 蛋白均與紅色熒光染色的gB 蛋白所指示的病毒噬斑形成良好的共定位(圖6)。以上結(jié)果表明,miRM11的編輯缺失不影響MDV 的噬斑形成及gB、Meq和pp38蛋白的正常表達。
圖6 HN302和HN302ΔM11感染CEF中的gB、Meq和pp38蛋白表達的IFA分析Fig.6 IFA analysis of the gB,Meq and pp38 protein expressions in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs
為測定miR-M11 的缺失是否影響MDV 的增殖,將HN302 和HN302ΔM11 分別感染6 孔細胞板CEF 單層,并在感染后24~144 h 內(nèi)每間隔24 h 收集1份樣品,提取總DNA 后檢測不同時間點MDV 基因gB、meq以及宿主OVO基因的拷貝數(shù),計算等量細胞內(nèi)病毒基因拷貝數(shù)并繪制病毒體外增殖曲線。結(jié)果顯示,與親本毒株HN302 相比,HN302ΔM11 的增殖速度更快,在等量接種感染CEF 后96 h 和120 h,基因缺失毒株的病毒增殖量均顯著高于親本毒株(圖7)。表明miR-M11 的編輯缺失顯著增強了MDV的體外復(fù)制能力。
圖7 HN302和HN302ΔM11在CEF中的增殖曲線Fig.7 Growth kinetics of HN302 and HN302ΔM11 viruses in CEFs
作為一種致瘤性α 皰疹病毒,MDV 在研究病毒致病和腫瘤形成機制中扮演重要角色。過去幾十年里,為研究MDV 編碼的基因功能,利用細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome,BAC)技術(shù),已構(gòu)建了多種不同毒株的感染性BAC 克隆[35-37]。隨后利用Rec E/T 同源重組技術(shù),可在BAC 克隆的基礎(chǔ)上進一步對目的基因進行敲除或敲入。近年來,利用該技術(shù)對MDV 編碼的miRNA 功能進行研究也陸續(xù)報道[16,18-19]。但是,皰疹病毒基因組很大,BAC克隆的構(gòu)建過程比較耗時費力,操作步驟煩瑣且Rec E/T 同源重組的效率較低。為方便突變體的篩選,往往還會在病毒基因組中插入外源的抗性篩選基因,如果作為疫苗候選毒株還需要進一步將其從基因組中剔除。此外,在研究miRNA 功能時,因剔除抗性篩選基因后殘余的重組序列元件如FRT 的大小與miRNA 相似,也會對miRNA 重組毒株的篩選和鑒定造成很大的困難。
CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)解決了BAC克隆和Rec E/T 同源重組技術(shù)的一些難題,因其構(gòu)建過程簡單,可直接靶向病毒基因組且編輯效率非常高,不會將外源片段殘留至病毒基因組內(nèi),很快在病毒學(xué)領(lǐng)域的基因功能研究及疫苗研發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用[26-28]。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),采用雙重敲除策略,構(gòu)建2 個gRNA 靶向MDV 國內(nèi)分離株HN302 編碼的miR-M11 基因,構(gòu)建了1 株穩(wěn)定的miR-M11 基因編輯缺失毒株HN302ΔM11。病毒體外增殖曲線測定的結(jié)果顯示,HN302ΔM11 在感染CEF 后96 h 和120 h 的病毒基因組拷貝數(shù)均顯著高于其親本毒株HN302,這與此前報道的GXΔmiR-M11 和RB-1BΔmiR-M11 基因缺失毒株的相關(guān)研究結(jié)果一致[19,33]。上述研究進一步證實,miR-M11 不僅不是病毒復(fù)制的必需基因,將其編輯缺失反而可以顯著增強MDV 的體外復(fù)制能力。但是miR-M11編碼的miRNA是直接調(diào)控MDV的病毒基因從而影響病毒增殖,還是通過靶向宿主基因及相關(guān)信號通路來調(diào)控細胞的增殖和/或凋亡以調(diào)節(jié)病毒復(fù)制,仍需要進一步深入研究。
在MDV-1 編碼的3 個miRNA 基因簇中,研究較多的是Meq 基因簇的miRNA。其中miR-M4-5p已被證實是宿主癌基因miR-155 的病毒同功分子,可能作為MDV 促癌因子參與腫瘤的形成;敲除Meq基因簇的其他miRNA(miR-M2、miR-M3、miR-M5、miR-M9和miR-M12)后,腫瘤的發(fā)生率也都顯著降低,表明Meq 基因簇的miRNA 在MD 腫瘤形成過程中發(fā)揮著重要作用[16-18]。Mid 基因簇和LAT 基因簇的miRNA 研究較少,其中Mid 基因簇miR-M31-3p的缺失也可顯著降低病毒的致病性和致瘤率,顯示出與miR-M4-5p 相似的調(diào)控功能[19]。前人研究表明,敲除GX0101 的miR-M4-5p 后,miR-M11 的表達水平明顯增加[18]。而本研究中發(fā)現(xiàn)miR-M11 被編輯缺失后,miR-M4-5p 和miR-M31-3p 的表達水平則顯著提高(P<0.05),這表明miR-M11 與另外2個miRNA 的表達水平在MD 發(fā)病或腫瘤發(fā)生過程似乎保持著相互的制約和平衡,miR-M11 很可能作為抑瘤基因參與調(diào)控MD 腫瘤的形成??傊?,本研究利用CRISPR/Cas9 基因編緝技術(shù)對HN302 的miR-M11 進行編輯和缺失,構(gòu)建1 株穩(wěn)定的miRM11 缺失毒株,為后續(xù)研究MDV 編碼miRNA 的調(diào)控功能及分子機制奠定了重要基礎(chǔ)。