王永生，朱水芬，陳 松，陳云明，江 亞，范永慧，楊啟慧，李瓊艷，楊 海

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.云南省蠶桑育種及高效生產(chǎn)工程研究中心，云南 蒙自 661101）

羧酸酯酶（Carboxylesterases，CarE）、乙酰膽堿酯 酶（Acetylcholinesterase，AchE）和 堿 性 磷 酸 酶（Alkaline phosphatase，ALP）是生物體重要的代謝酶類[1-2]。CarE 是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和昆蟲體內(nèi)的代謝解毒酶，不僅能將內(nèi)源性或外源性含有酯鍵的化合物分解為對(duì)應(yīng)的醇和酸，而且在機(jī)體脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和發(fā)育調(diào)控等方面也發(fā)揮了一定的功能[3-4]。AchE 是生物體一種極其重要的神經(jīng)遞質(zhì)水解酶，其主要功能是在膽堿能神經(jīng)突觸處通過快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach），從而終止Ach 對(duì)乙酰膽堿受體的刺激作用，保證神經(jīng)沖動(dòng)在突觸間的正常傳導(dǎo)，維持生物體的正常生理功能。同時(shí)，AchE還是有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的重要作用靶標(biāo)[5-6]。CarE 和AchE 作為昆蟲機(jī)體重要的兩類酯酶，主要介導(dǎo)昆蟲機(jī)體的抗逆性過程[7-8]。家蠶CarE 和AchE 在機(jī)體代謝有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥以及抵御病原微生物侵染過程中發(fā)揮了一定的功能，它們的活性大小在一定程度上反映了蠶體的代謝及生理狀態(tài)[8-9]。ALP 是一類高度保守的磷酸水解酶，直接參與了生物體磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過程[10-11]。ALP 不僅參與昆蟲的生長發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)、物質(zhì)代謝和滯育等過程，而且還參與了昆蟲機(jī)體的解毒代謝和免疫防御過程[12-13]。已有研究表明，ALP 參與家蠶機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收，該酶活性的增強(qiáng)有助于提高蠶體的抗逆性及繭絲產(chǎn)量和質(zhì)量[14]。

家蠶（Bombyx mori）作為一種重要的特種經(jīng)濟(jì)昆蟲，主要以桑葉為單一食物來源。人工飼料是根據(jù)家蠶的食性特點(diǎn)和營養(yǎng)要求配制成的用以代替桑葉的飼料，因其可以突破季節(jié)限制、便于實(shí)行機(jī)械化，越來越受到人們的關(guān)注[15]。人工飼料養(yǎng)蠶是今后養(yǎng)蠶業(yè)發(fā)展的重要方向，但是與桑葉飼育相比，全齡用人工飼料飼育的蠶存在體質(zhì)弱、發(fā)育不齊、產(chǎn)絲量少等問題[16]。改良人工飼料的配方，探索適宜的人工飼料添加劑，使其有利于激活蠶體代謝酶和解毒酶活性，增強(qiáng)自身體質(zhì)和提高抗逆性，成為亟待解決的問題。CarE、AchE 和ALP 對(duì)昆蟲機(jī)體生物代謝的穩(wěn)定性極其重要，其活性大小與機(jī)體的生理狀態(tài)及抗逆性和抗病性密切相關(guān)。目前，關(guān)于人工飼料對(duì)家蠶體內(nèi)ALP、AchE 和CarE 活性影響的研究尚未見報(bào)道。

鑒于此，通過比較家蠶取食人工飼料和桑葉后機(jī)體不同組織ALP、AchE 和CarE 的活性差異，探究人工飼料和桑葉飼育對(duì)蠶體3 種代謝酶活性的影響，明確飼料因素的變化對(duì)家蠶抗性生理的影響，以期為優(yōu)化和改良人工飼料配方及飼育技術(shù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 家蠶來源

P50家蠶品種由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、雪科牌IMS-40 雪花制冰機(jī)和HSW24 型電熱恒溫水浴鍋購自廣州深華生物技術(shù)有限公司；ThermoFisher 雙光束紫外/可見分光光度計(jì)和高速冷凍離心機(jī)購自昆明伯騰儀器有限公司。

1.2.2 主要試劑 家蠶人工飼料購自重慶正佳飼料有限公司；無水乙醇和冰醋酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號(hào)：P0012S）購自碧云天生物技術(shù)有限公司。堿性磷酸酶ALP 活性檢測試劑盒（貨號(hào)：BC2140）、羧酸酯酶CarE 活性檢測試劑盒（貨號(hào)：BC0840）和乙酰膽堿酯酶AchE 活性檢測試劑盒（貨號(hào)：BC2020）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 處理分組和樣品采集 用新鮮桑葉飼養(yǎng)家蠶至五齡起，隨機(jī)分成2 組，一組繼續(xù)用桑葉飼養(yǎng)，另一組改用人工飼料飼養(yǎng)。從開始進(jìn)食計(jì)時(shí)，隨后每隔12 h，冰上解剖家蠶幼蟲，取血淋巴、中腸組織?？偣踩〔? 次（取材時(shí)間點(diǎn)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h）。2 個(gè)處理組每次取樣均設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取4 頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存。

1.3.2 酶液制備和活性測定 中腸組織酶液制備：取0.5 g 的中腸組織放入預(yù)冷的研缽中，分別加入1.5 mL 各個(gè)酶活性測定試劑盒提供的抽提液，迅速充分研磨勻漿，隨后將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，吸取上清液作為待測酶液。血淋巴酶液制備：取350 μL血淋巴，分別加入1.0 mL 酶活性測定試劑盒提供的抽提液，隨后在4 ℃條件下10 000 r/min 離心10 min，棄沉淀取上清液，即為待測酶液。按照BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒和3種酶（堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶）試劑盒操作分別測定蛋白質(zhì)濃度和酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016 和SPSS 21.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工飼料和桑葉飼育的家蠶不同組織ALP活性變化

圖1為喂食人工飼料和桑葉后家蠶血淋巴和中腸組織中ALP 活性變化情況。由圖1A 可知，在測定的時(shí)間內(nèi)，喂食人工飼料組家蠶血淋巴中ALP 活性變化不明顯，而桑葉組ALP 活性在后期明顯增強(qiáng)。在12～48 h，喂食人工飼料組和桑葉組血淋巴ALP 活性無顯著差異，而在60、72 h，桑葉組的ALP活性顯著高于人工飼料組（P＜0.05），酶活性分別為人工飼料組的1.42、1.81倍。

圖1B 結(jié)果顯示，桑葉組家蠶中腸ALP 活性在36 h 開始顯著高于人工飼料組，在48、60、72 h 酶活性持續(xù)增強(qiáng)，且極顯著高于人工飼料組（P＜0.01），酶活大小分別是人工飼料組的2.88、1.86、2.13倍。

圖1 人工飼料和桑葉對(duì)家蠶血淋巴（A）和中腸（B）ALP活性的影響Fig.1 Effects of artificial diet and mulberry leaves on ALP enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

2.2 人工飼料和桑葉飼育的家蠶不同組織CarE活性變化

圖2A 結(jié)果顯示，家蠶血淋巴中CarE 活性整體呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢，其中人工飼料組酶活性略高于桑葉組，但差異不顯著。由圖2B可知，在12 h，人工飼料組和桑葉組中腸CarE活性無差異；而在24 h和36 h，人工飼料組CarE 活性開始增強(qiáng)，并顯著高于桑葉組（P＜0.05）；隨著喂食時(shí)間的延長，人工飼料組中腸CarE 活性持續(xù)增加，在48 h 和60 h，CarE活性極顯著高于桑葉組（P＜0.01），其中在60 h，酶活性升至最高值，約為桑葉組的2.61 倍；而在72 h，CarE 活性雖有一定程度的降低，但仍顯著高于桑葉組（P＜0.05）。

圖2 人工飼料和桑葉對(duì)家蠶血淋巴（A）和中腸（B）CarE活性的影響Fig.2 Effects of artificial diet and mulberry leaves on CarE enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

2.3 人工飼料和桑葉飼育的家蠶不同組織AchE活性變化

如圖3A 所示，在12 h 和24 h，喂食桑葉組血淋巴AchE 活性略低于人工飼料組，但差異不顯著。在36 h，桑葉組血淋巴AchE 活性開始增加并且在48 h、60 h和72 h持續(xù)高于人工飼料組，分別是人工飼料組的1.52 倍、1.64 倍和1.71 倍，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。圖3B結(jié)果表明，在測定的時(shí)間范圍內(nèi)，喂食桑葉組家蠶中腸AchE 活性均比人工飼料組高。其中在12～48 h，桑葉組AchE 活性顯著高于人工飼料組（P＜0.05）；隨著喂食時(shí)間的推移，桑葉組AchE 活性繼續(xù)增強(qiáng)，在60 h 和72 h 持續(xù)高于人工飼料組，且差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），AchE活性分別為人工飼料組的2.68倍和2.84倍。

圖3 人工飼料和桑葉對(duì)家蠶血淋巴（A）和中腸（B）AchE活性的影響Fig.3 Effects of artificial diet and mulberry leaves on AchE enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

3 結(jié)論與討論

ALP、CarE 和AchE 被認(rèn)為是昆蟲機(jī)體重要的三大代謝酶，其活性大小受到不同植物飼料、病原微生物及生長環(huán)境的影響。薛英偉等[17]比較了桑葉和柘葉對(duì)家蠶ALP、AchE、CarE 活性的影響，發(fā)現(xiàn)柘葉飼養(yǎng)組蠶體內(nèi)的ALP 和AchE 活性比桑葉飼養(yǎng)組顯著降低，而CarE的活性顯著高于桑葉組。家蠶感染核型多角體病毒（BmNPV）后，蠶體內(nèi)的CarE 活性會(huì)大幅度上升，ALP 與AchE 活性顯著下降。另外，接種家蠶濃核病毒（BmDNV）后12 h，家蠶抗性品系中腸羧酸酯酶基因BmCarE及其酶活性顯著升高，提示羧酸酯酶在抵御BmNPV 和BmDNV 過程發(fā)揮一定的功能[18]。喂食槲皮素，能有效誘導(dǎo)CarE 的活性，并且酶活性隨喂食槲皮素濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，暗示CarE具有對(duì)外源物質(zhì)解毒代謝的功能[19]。韓琨[20]的研究結(jié)果表明，人工飼料育家蠶中腸的α-淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶等活性均低于桑葉育家蠶。

本研究測定了人工飼料和桑葉飼育對(duì)五齡家蠶中腸和血淋巴ALP、CarE 和AchE 活性的影響，結(jié)果顯示，桑葉組的ALP 和AchE 活性在家蠶血淋巴和中腸中均顯著高于人工飼料組。另外，桑葉組家蠶血淋巴CarE活性與人工飼料組無明顯差異，而中腸CarE 活性顯著低于人工飼料組。一般認(rèn)為，ALP和AchE 活性大小反映了昆蟲正常生理代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱。ALP 是昆蟲體內(nèi)調(diào)控磷酸代謝的關(guān)鍵酶，參與了機(jī)體的能量代謝和生長發(fā)育過程[13-14]。AchE作為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶，其活性大小是機(jī)體細(xì)胞代謝狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)[21-22]。抑制昆蟲AchE基因的表達(dá)，降低AchE 活性，幼蟲會(huì)出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩，雌性成蟲的造卵量和產(chǎn)卵率也顯著降低[22-23]。CarE 被認(rèn)為是昆蟲機(jī)體負(fù)責(zé)解毒的重要水解酶，其活性受到外源化合物、次生代謝產(chǎn)物及其他 病 原 微 生 物 的 影 響[2-3]。ZHOU 等[24]和CAPPELLOZZA 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，人工飼料飼育的家蠶，機(jī)體能量代謝進(jìn)程減緩，幼蟲抗病性弱，絲蛋白合成減少，分析認(rèn)為是家蠶進(jìn)食人工飼料后，參與物質(zhì)能量代謝的一系列相關(guān)酶活性受到不同程度的抑制，影響了正常的生理代謝活動(dòng)。喂食人工飼料的家蠶中腸CarE酶活性顯著高于桑葉飼喂組，推測可能是人工飼料中的某些成分或是代謝產(chǎn)物對(duì)中腸組織有一定的損傷或毒害作用，進(jìn)而導(dǎo)致CarE活性的升高。綜上，采用人工飼料飼養(yǎng)的家蠶，其血淋巴和中腸三大代謝酶活性受到一定的影響，導(dǎo)致蠶體正常的生理代謝進(jìn)程受阻，抵御不良環(huán)境的能力減弱。