李文嘉，徐 彬，魏鳳仙，鄧 文，馬慧慧，王琳燚，白 杰，孫全友，席燕燕，李紹鈺

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

2021 年我國肉雞出欄量超90 億只，高需求不斷催生養(yǎng)殖業(yè)轉(zhuǎn)向集約化、快速化[1]。但隨之而來的問題也層出不窮，最為突顯的是畜禽對高密度飼養(yǎng)環(huán)境的應(yīng)激強(qiáng)烈[2]，嚴(yán)重影響家禽生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)。諸多研究指出，集約化、高密度飼養(yǎng)降低肉雞生長性能、飼料效率和胴體性狀，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)，并對肉雞腸道功能造成損傷[3-5]。然而，為了提高經(jīng)濟(jì)效益、維持養(yǎng)殖動物健康，企業(yè)會選擇在飼料中添加低于治療劑量的抗生素以提高生產(chǎn)率[6-7]。這直接導(dǎo)致抗生素的濫用和畜產(chǎn)品安全問題，因此，我國自2020 年7 月1 日起，嚴(yán)禁飼料企業(yè)向商品飼料中添加促生長類藥物（中藥類除外）[8]。然而隨著我國禁抗的全面實(shí)施，以及人民對食品安全問題的日益重視，在維持動物生產(chǎn)性能的同時(shí)需要提高其產(chǎn)品品質(zhì)，亟需尋找一種或多種可增強(qiáng)家禽自然防御能力的抗生素替代品。

目前，可供選擇且安全的抗生素替代品包括植物提取物、益生菌、中成藥制劑等[9]。其中，益生菌被認(rèn)為是一種具有生物活性且對宿主有正面效益的微生物，相對于其他抗生素替代品還具有易制備、成分單一、純度高、成本低等特點(diǎn)。近10 a 來，益生菌受到廣泛的研究，在家禽養(yǎng)殖業(yè)中通常使用的益生菌有乳酸菌類、丁酸梭菌類、芽孢桿菌類等。研究指出，益生菌不僅可以促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長、飼料利用以及改善肉蛋品質(zhì)，更重要的是對腸道屏障功 能 有 促 進(jìn) 作 用[10-12]。丁 酸 梭 菌（Clostridiumbutyricum）是一種革蘭氏陽性厭氧菌，通常存在于人和動物的腸道以及糞便中[13]。作為一種常見的益生菌，丁酸梭菌對動物胃液、腸液中的消化酶以及膽汁都具有較強(qiáng)耐受性，易于在動物腸道中定殖，并建立酸性環(huán)境，從而起到抑制腸道中的致病菌的作用；同時(shí)，丁酸梭菌還可以產(chǎn)生丁酸——短鏈脂肪酸（SCFA）中的一種，是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營養(yǎng)物質(zhì)，具有促進(jìn)肉雞腸道發(fā)育、增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的作用[14-15]。有研究指出，飼料中添加丁酸梭菌可改善養(yǎng)殖動物生長性能，提高免疫功能和抗氧化能力，維持或恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)[16]。為此，以肉雞為研究對象，以有效調(diào)節(jié)肉雞腸道健康、促進(jìn)肉雞生長為切入點(diǎn)，研究日糧中添加丁酸梭菌對肉雞腸道形態(tài)、腸道屏障功能以及生長性能的影響，為丁酸梭菌在肉雞生產(chǎn)中作為一種抗生素替代品被更加廣泛的使用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸梭菌制劑活菌數(shù)為3×109cfu/g（浙江惠嘉生物技術(shù)有限公司）；抗生素為含50%的維吉尼亞霉素。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取健康且體態(tài)接近的1 日齡愛拔益加（AA）肉仔雞[平均體質(zhì)量為（44.39±0.14）g]324 只，隨機(jī)分成3 個(gè)處理，每處理6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18 只仔公雞。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧主要參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)計(jì)，配制成以玉米、豆油為主要能量源，豆粕為主要蛋白質(zhì)源的粉狀飼料（表1）。對照組（CON）飼喂基礎(chǔ)日糧，抗生素組（ANT）和丁酸梭菌組（CB）分別飼喂基礎(chǔ)日糧中含10 mg/kg 維吉尼亞霉素和1×109cfu/kg丁酸梭菌的日糧。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2020 年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所尉氏養(yǎng)殖基地（開封市尉氏縣）進(jìn)行。采用雙層籠養(yǎng)（1 m×1 m）方式進(jìn)行飼養(yǎng)，雞舍內(nèi)光照黑暗時(shí)間比為23∶1，試驗(yàn)期間雞只自由采食飲水，并同時(shí)按正常免疫程序進(jìn)行接種。舍內(nèi)初始溫度由1日齡時(shí)的34 ℃逐步降低穩(wěn)定至21日齡時(shí)的24 ℃。試驗(yàn)期為42 d，分為前期（1—21 日齡）和后期（22—42日齡）2個(gè)階段。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能指標(biāo)測定 試驗(yàn)開始第1 日，記錄肉雞體質(zhì)量。于42日齡，稱量并記錄各組肉雞余料量、耗料量、死亡數(shù)以及測定肉雞末體質(zhì)量。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算平均日增質(zhì)量（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.4.2 血清指標(biāo)測定 分別于21、42 日齡，各組重復(fù)中隨機(jī)選取肉雞2 只，由翅靜脈處采血5 mL，于常溫下放置20 min 后離心15 min（3 000 r/min），-80 ℃分裝保存。采用酶聯(lián)免疫（ELISA）競爭法測定血清中細(xì)胞因子及焦亡相關(guān)蛋白水平，包括白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和半胱天冬酶-1（Caspase-1），具體操作參照相關(guān)試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書進(jìn)行。

1.4.3 腸道黏膜采集和相關(guān)指標(biāo)測定 取完血清后用30 mg/mL 的戊巴比妥鈉稀釋液將肉雞麻醉致死。雞處死后迅速剖開腹腔，截取空腸腸段并用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液沖洗食糜，刮取腸黏膜至凍存管中，-80 ℃保存，用于分泌型免疫球蛋白A（sIgA）含量測定（按照南京建成生物工程研究所試劑盒操作說明進(jìn)行）和腸黏膜總RNA提取。

肉雞空腸黏膜總RNA 使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 提 取。采 用TaKaRa 試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix 將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)置內(nèi)參基因?yàn)槿姿岣视腿┟摎涿富颍℅APDH），按照TaKaRa 試劑盒TB Green?Premix ExTaq?Ⅱ說明書配制相應(yīng)反應(yīng)體系，使用熒光定量反應(yīng)儀器（Light Cycler 96，羅氏）進(jìn)行熒光定量PCR，檢測目的基因IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18、Claudin-1、Occludin-1、ZO-1和Caspase-1，其引物序列見表2。采用相對定量法（2-ΔΔCT）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[17]。

表2 內(nèi)參基因和目的基因引物序列Tab.2 Primer sequences of targeted and reference genes

1.4.4 腸道組織形態(tài)測定 取未采集過腸黏膜的十二指腸、空腸和回腸腸段置于冰上，用準(zhǔn)備好的緩沖液稍作沖洗，以去除腸道內(nèi)容物，分別收集長度為3 cm 的完整中段，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。后經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊等處理，制作石蠟切片（Leica RM 2016，德國），用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡（Olympus BX53，奧林巴斯光學(xué)公司，深圳，中國）下觀察空腸、回腸和十二指腸形態(tài)學(xué)指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)并測算隱窩深度（Crypt depth）、絨毛高度（Villus height）以及絨毛高/隱窩深（V/C）比值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0 軟件中的one-way ANOVA 分析（單因素方差分析）。用Duncan氏法進(jìn)行組間差異性多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

由表3 可知，在試驗(yàn)全期，與對照組相比，抗生素組和丁酸梭菌組的平均日增質(zhì)量以及末質(zhì)量分別升高6.31%、8.43%和6.26%、8.31%。丁酸梭菌組料重比與對照組相比顯著下降3.28%。各組之間平均日采食量無明顯變化。

表3 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響Tab.3 Effects ofC.butyricumon growth performance of broilers

2.2 丁酸梭菌對肉雞血清細(xì)胞因子和焦亡相關(guān)蛋白水平的影響

由表4 可知，在焦亡蛋白方面，血清Caspase-1水平在21 日齡沒有受到影響（P＞0.05）；在42 日齡，與對照組相比，丁酸梭菌組Caspase-1和IL-18水平顯著下降24.91%和42.96%（P＜0.05）。在細(xì)胞因子方面，與對照組相比，丁酸梭菌組IL-1β 在21、42 日齡分別顯著降低19.34%、19.91%（P＜0.05）；血清IL-10水平無顯著變化（P＞0.05）。

表4 丁酸梭菌對肉雞血清細(xì)胞因子和焦亡相關(guān)蛋白水平的影響Tab.4 Effects ofC.butyricumon serum cytokines and pyroptosis-related proteins of broilers ng/L

2.3 丁酸梭菌對肉雞腸黏膜sIgA的影響

由表5 可知，空腸sIgA 水平在21 日齡沒有明顯變化（P＞0.05）；在42 日齡，丁酸梭菌組與對照組相比肉雞空腸sIgA顯著升高26.50%（P＜0.05）。

表5 丁酸梭菌對21日齡和42日齡肉雞空腸sIgA的影響Tab.5 Effects ofC.butyricumon sIgA in jejunum of broilers at 21 and 42 days ng/mg

2.4 丁酸梭菌對肉雞腸道形態(tài)的影響

由表6可知，空腸中與對照組相比，丁酸梭菌組和抗生素組絨毛高度與V/C 比值分別顯著提高13.40%、54.20%和37.34%、55.39%；各組間隱窩深度無顯著差異。十二指腸中，與對照組相比，抗生素組絨毛高度與V/C 比值分別提高21.93% 和56.57%（P＜0.05），隱窩深度顯著下降21.66%（P＜0.05）?；啬c中，與對照組相比，抗生素組絨毛高度顯著升高37.40%（P＜0.05），丁酸梭菌組隱窩深度顯著下降32.62%（P＜0.05），丁酸梭菌組和抗生素組V/C 比值顯著高于對照組60.76% 和56.93%（P＜0.05）。

表6 丁酸梭菌對42日齡肉雞腸道形態(tài)的影響Tab.6 Effects ofC.butyricumon intestinal morphology of broilers at 42 days

2.5 丁酸梭菌對肉雞腸道黏膜細(xì)胞焦亡和腸道屏障相關(guān)基因mRNA表達(dá)豐度的影響

由圖1 可知，在42 日齡丁酸梭菌和抗生素組腸黏膜IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-18mRNA 相對表達(dá)豐度顯著低于對照組（P＜0.05）。在21、42 日齡，對照組腸黏膜Caspase-1mRNA 相對表達(dá)豐度均顯著高于丁酸梭菌和抗生素組（P＜0.05）。在21 日齡，與對照組相比，丁酸梭菌組、抗生素組閉合小環(huán)蛋白-1 基因（ZO-1）mRNA 表達(dá)水平均顯著上調(diào)。在21 日齡，各組間閉合蛋白-1 基因（Claudin-1）mRNA 水平差異不顯著（P＞0.05）；在42 日齡，丁酸梭菌組Claudin-1mRNA 相對表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。各組間IL-10和Occludin-1mRNA表達(dá)量均無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 丁酸梭菌對肉雞空腸黏膜細(xì)胞焦亡和腸道屏障相關(guān)基因mRNA表達(dá)豐度的影響Fig.1 Effects ofC.butyricumon mRNA relative expression level of pyroptosis and intestinal barrier related genes in jejunum mucosa of broilers

3 結(jié)論與討論

3.1 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

高密度飼養(yǎng)會導(dǎo)致肉雞產(chǎn)生較大的環(huán)境應(yīng)激，病害頻發(fā)，經(jīng)濟(jì)效益下降[18]。益生菌是一種具有生物活性的可以改善家禽生長及免疫性能等對宿主有正面效益的微生物[12]。本研究結(jié)果顯示，與飼喂基礎(chǔ)日糧組相比，丁酸梭菌添加組肉雞平均日增質(zhì)量和末質(zhì)量顯著升高，料重比顯著降低，與賈聰慧等[2]、趙強(qiáng)等[19]、LIAO 等[20]和ZHANG 等[16，21]的研究結(jié)果一致。這表明飼料中添加一定量的丁酸梭菌可以促進(jìn)肉雞的生長，并可作為一種抗生素的替代品。這可能是由于丁酸梭菌在家禽體內(nèi)可產(chǎn)生消化酶、SCFA 及維生素等益生物，并以此促進(jìn)家禽對營養(yǎng)物質(zhì)的利用[22]；另外，丁酸梭菌還能通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點(diǎn)從而抑制有害菌的生長，改善腸道菌群環(huán)境[23]。然而，有關(guān)丁酸梭菌在家禽飼料中添加量以及應(yīng)用效果的報(bào)道不盡相同[24]。其原因可能是各個(gè)試驗(yàn)所用的菌種、劑型和發(fā)酵水平有所不同，養(yǎng)殖品種、階段及管理水平也有差異所致[25]。

3.2 丁酸梭菌對肉雞腸道形態(tài)的影響

腸道是動物消化、吸收營養(yǎng)的重要場所，腸道形態(tài)的完整性，尤其是絨毛高度、隱窩深度及V/C值是衡量腸道功能的關(guān)鍵指標(biāo)。腸道功能與隱窩深度呈負(fù)相關(guān)性，與絨毛高度呈正相關(guān)[22]。前人研究表明，日糧中添加丁酸梭菌能顯著改善養(yǎng)殖動物腸絨毛萎縮和隱窩增生現(xiàn)象[26-27]，使空腸和回腸絨毛長度顯著增加[28]，提高腸絨毛高和V/C 比值[29]。本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌顯著增加了肉雞腸道的絨毛高度和V/C 比值，降低了隱窩深度。說明丁酸梭菌對肉雞腸道發(fā)育有促進(jìn)作用，間接增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)在消化道中的吸收作用。其作用機(jī)制可能是丁酸作為丁酸梭菌主要代謝產(chǎn)物，是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營養(yǎng)物質(zhì)，對家禽腸上皮組織的增殖與發(fā)育以及維持其形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用[30]。

3.3 丁酸梭菌對肉雞腸道免疫和屏障功能的影響

炎癥反應(yīng)具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，且過度的炎癥反應(yīng)會對機(jī)體造成不可逆的損傷[31-32]。本研究結(jié)果顯示，與飼喂基礎(chǔ)日糧組相比，丁酸梭菌組肉雞血清 中IL-1β 含 量 及 腸 道 黏 膜TNF-α和IL-1β的mRNA 相對表達(dá)量顯著降低。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌組肉雞血清中IL-10 含量、腸黏膜中相對表達(dá)量相較于對照組有所上升。李玉鵬等[33]在斷奶仔豬試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可提高仔豬血清中IL-10含量，降低血清中IL-1β含量。這可能是由于本研究采用高密度飼養(yǎng)模式，高密度飼養(yǎng)會導(dǎo)致肉雞機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)[3]；另外，丁酸梭菌可以緩解應(yīng)激環(huán)境引起的肉雞機(jī)體炎癥反應(yīng)。具體作用機(jī)制可能是丁酸梭菌通過激活腸上皮細(xì)胞中TLR2/MyD88信號通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-10，來達(dá)到抗炎的效果[34]；或通過調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路，來調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[35]。

腸道屏障所包含的腸細(xì)胞緊密連接對于腸道的通透性、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用、疾病的產(chǎn)生與發(fā)展以及抵抗病原菌和毒素的侵入等起著至關(guān)重要的作用[36-38]。本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌組緊密連接蛋白ZO-1和閉合蛋白Claudin-1mRNA 表達(dá)水平顯著高于對照組。ZONG 等[39]和李玉鵬等[33]研究指出，在斷奶仔豬日糧中添加丁酸梭菌可提高腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA表達(dá)量。楊明月[40]在對獺兔的研究中發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可顯著提高獺兔腸道總緊密連接蛋白相對表達(dá)豐度。在腸道免疫屏障中，腸黏膜sIgA 是主要的免疫球蛋白，作為抵御各種內(nèi)源性共生菌和外源性病原菌的重要防線。楊彩梅等[41]研究表明，在肉雞日糧中添加丁酸梭菌，可提高腸黏膜sIgA 含量。鄭江平等[42]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加乳酸菌能顯著增加肉雞sIgA 的水平?？梢?，丁酸梭菌對肉雞腸道屏障功能有一定的促進(jìn)作用。其作用機(jī)制可能是丁酸梭菌可通過分泌丁酸為腸上皮細(xì)胞供能，促進(jìn)上皮細(xì)胞生長和修復(fù)[25]。

細(xì)胞焦亡是一種炎癥程序性細(xì)胞死亡過程[43]。細(xì)胞焦亡依賴于Caspase-1 的活化，Caspase-1 可介導(dǎo)胞內(nèi)滲透壓凈增加，誘導(dǎo)細(xì)胞膨大破裂，釋放炎性物質(zhì)；同時(shí)，活化的Caspase-1還可以促進(jìn)pro-IL-1β和pro-IL-18 的成熟，使之形成有活性的IL-1β 和IL-18[44-45]。本研究中，丁酸梭菌組肉雞血清中Caspase-1、IL-1β 和IL-18 含 量 及 腸 黏 膜 中 其mRNA 表達(dá)量顯著下降。由此推測，丁酸梭菌可緩解肉雞細(xì)胞炎性焦亡的發(fā)生，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上，日糧中添加1×109cfu/kg丁酸梭菌能提高肉雞的生長性能和飼料利用率，改善肉雞腸道形態(tài)，提升腸道屏障功能，并能在一定程度上緩解肉雞的腸道細(xì)胞焦亡。