尚 辰,郝文婷,任義樂
(徐州市第一人民醫(yī)院,江蘇 徐州 221000)
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種典型的慢性自身免疫性疾病,其特征是關(guān)節(jié)呈進(jìn)行性對(duì)稱性破壞并伴有全身炎癥反應(yīng)[1]。該病與幾種代謝性疾病和心血管疾病等共病高度相關(guān)[2]。值得注意的是,先天性危險(xiǎn)因素(如遺傳、性別和年齡)和獲得性危險(xiǎn)因素(如肥胖、吸煙和創(chuàng)傷)與RA 的分解代謝及炎癥過程有關(guān)[3-5]。幾種脂肪來源的細(xì)胞因子,如瘦素、脂聯(lián)素和內(nèi)脂素在局部或全身水平的紊亂,對(duì)RA 的炎癥和分解代謝改變起著重要作用[3]。其中內(nèi)脂素是一種新型的脂肪因子,已有研究發(fā)現(xiàn)其是炎癥和代謝過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。內(nèi)脂素也被稱為煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(NAMPT),是哺乳動(dòng)物中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生物合成補(bǔ)救途徑中的限速酶。NAD+ 是一種普遍存在的參與氧化還原反應(yīng)的輔酶,在氧化應(yīng)激條件下,需要增加NAD+ 的再生,因此,內(nèi)脂素作為NAD+ 代謝的調(diào)節(jié)因子在基本細(xì)胞過程中占有關(guān)鍵地位[6]。谷胱甘肽(GSH)是人體內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì),前期研究[7]已證明GSH可能通過降低成纖維滑膜細(xì)胞中的活性氧(ROS)水平進(jìn)一步抑制炎癥因子的釋放,本試驗(yàn)進(jìn)一步研究其對(duì)脂肪因子中內(nèi)脂素的影響。
MH7A 細(xì)胞系(購(gòu)自上海觀道生物科技有限公司);健康清潔級(jí)雌性DBA/1J 小鼠14 只(購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司),7 ~8 周齡。
GSH(北京索萊寶科技有限公司);牛Ⅱ型膠原(Chondrex 公司,貨號(hào):2002-2);弗氏完全佐劑(含卡介苗,CFA,Chondrex 公司);弗氏不完全佐劑(不含卡介苗,IFA,Chondrex 公司);1640 培養(yǎng)基(SH30265.01,美國(guó)Hyclone);低糖DMEM 培養(yǎng)基(SH30021.01B,美國(guó)Hyclone);胎牛血清(FBS,10100147,美國(guó)Gibco);青- 鏈霉素溶液(15140,美國(guó)Gibco);內(nèi)脂素ELISA 試劑盒(eBioscience 公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara Bio Inc.);熒光定量PCR 儀(ABI7500)。
將14 只雌性DBA/1J 小鼠隨機(jī)分為CIA+PBS 組、CIA+GSH 組。將牛Ⅱ型膠原與CFA 等體積混合乳化制成混懸乳劑,在無菌條件下以每只0.1 mg 的劑量在小鼠尾根部皮下注射,首免當(dāng)日記為1 d。在21 d將牛Ⅱ型膠原與IFA 等體積混合乳化,再次注射于小鼠尾根部皮下,劑量同前。CIA+GSH 組自第1 d 至第50 d 通過灌胃給予500 mg/kg GSH,CIA+PBS 組同時(shí)每日給予等量PBS 灌胃處理。所有小鼠均正常飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)環(huán)境。
首免50 d 后處死兩組小鼠,取出后肢股骨及脛骨,剝離骨表面肌肉和軟組織,去除股骨和脛骨骨骺端,將骨髓從骨髓腔中沖出,制成細(xì)胞懸液。以1640 完全培養(yǎng)基(1640 培養(yǎng)基+10% FBS+1% 青-鏈霉素溶液+10% L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清)重懸細(xì)胞后種于6 孔板中。細(xì)胞貼壁后直至其長(zhǎng)滿,每3 d 換液1 次,此時(shí)的貼壁細(xì)胞為BMDM。
將BMDM 細(xì)胞送往廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序,提取總RNA,并質(zhì)檢合格,建立文庫(kù)。獲得原始測(cè)序短序列,經(jīng)過濾得到短序列Clean Reads 為有效數(shù)據(jù)。采用DESeq2 軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析(P<0.05),篩選出兩組間差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs),進(jìn)行基因本體(Gene ontology,GO)功能顯著性富集分析。
將MH7A 細(xì)胞分為PBS 組、GSH 組(GSH 100 μg/mL)、LPS(100 ng/mL)組、GSH+LPS 組,處理24 h 后收集細(xì)胞以及細(xì)胞上清。
測(cè)定RNA 濃度后每個(gè)樣本取1 μg 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系和試驗(yàn)方法參照說明書。根據(jù)SYBR說明書進(jìn)行后續(xù)的實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素。內(nèi)脂素上、下游引物序列分別為5’-CGACTCCTACAAGGTTACTCACTATAAAC-3’和 5’-CTTCTCAAGAATGTAGTTCCATCCC-3’,瘦 素 上、 下 游 引 物 序 列 分 別 為5’-TGGTTTCATTTCTACTGTGACTGATG-3’ 和5’-TCCTAAGCAATTGCAGAAGATAAG-3’, 脂 聯(lián)素上、下游引物序列分別為5’-CCCCAACATGC-3’和5’-TACACCTGGAGCCAGACTTGG-3’。得到CT值,以GAPDH 為內(nèi)參,用2-ΔΔCt 計(jì)算分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。
根據(jù)eBioscience 公司生產(chǎn)的ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清內(nèi)脂素的表達(dá)情況。
我們采用RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素mRNA 表達(dá),結(jié)果顯示與LPS 組相比,LPS+GSH 組細(xì)胞中內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素mRNA 水平均顯著下降(P<0.05)。見圖1。
圖1 GSH 干預(yù)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的MH7A 成纖維滑膜細(xì)胞中內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素mRNA 表達(dá)的影響
與LPS 組相比,LPS+GSH 組的細(xì)胞上清內(nèi)脂素蛋白水平顯著降低。見圖2。
圖2 GSH 干預(yù)對(duì)MH7A 成纖維滑膜細(xì)胞上清內(nèi)脂素蛋白表達(dá)水平的影響
GSH 干預(yù)對(duì)CIA 鼠BMDM 內(nèi)脂素mRNA 表達(dá)的影響見表1。
表1 CIA+GSH vs CIA+PBS 差異基因
在過去的幾年中,有研究表明代謝因素特別是脂肪組織和脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的大量脂肪因子,參與了RA的炎癥過程。脂肪因子相互作用,部分相互誘導(dǎo),形成脂肪因子網(wǎng)絡(luò),對(duì)滑膜炎癥以及軟骨、骨侵蝕起到一定的促進(jìn)作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn),相比于正常對(duì)照組,LPS 刺激MH7A 細(xì)胞后多種脂肪因子表達(dá)升高,如內(nèi)脂素、瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素,這與既往的研究結(jié)果相一致。給予GSH 干預(yù)后可顯著下調(diào)脂肪因子的表達(dá)。GSH 能夠改變脂肪因子表達(dá)的原因可能是基于其生物學(xué)特性。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種三肽,含有巰基(-SH),它是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基,又是乙二醛酶及丙糖脫氫酶的輔酶,參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝。GSH 廣泛分布于機(jī)體各器官內(nèi),它是多種酶的輔酶,能激活多種酶,影響糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝,為維持細(xì)胞的生理功能提供能量[9]。本研究中我們進(jìn)一步研究了GSH 干預(yù)對(duì)內(nèi)脂素表達(dá)的影響。內(nèi)脂素是一種新型的脂肪因子,是炎癥和代謝過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[4]。它又被稱為NAMPT,是細(xì)胞質(zhì)中NAD+ 前體的催化物,也是哺乳動(dòng)物特異性NAD+ 挽救途徑中的限速酶。內(nèi)脂素的催化活性促使煙酰胺(NA)在細(xì)胞質(zhì)中合成煙酰胺單核苷酸(NMN)。NMN 隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體,通過NMN 腺苷轉(zhuǎn)移酶(NMA)轉(zhuǎn)化為NAD+。NAD+及其磷酸化形式NADP 被認(rèn)為是其作為普遍信號(hào)傳導(dǎo)和能量分子的生命必需品。內(nèi)脂素對(duì)NAD+ 的調(diào)控意味著任何NAD+ 依賴的基本過程,如細(xì)胞氧化還原電位、氧化應(yīng)激、聚合酶、環(huán)化酶和蛋白表達(dá)、細(xì)胞黏附或衰老都可以通過內(nèi)脂素調(diào)控。
有一項(xiàng)薈萃分析研究[10]和幾項(xiàng)獨(dú)立研究[11-18]表明RA 患者血清以及外周血中單個(gè)核細(xì)胞可表達(dá)更高的內(nèi)脂素,內(nèi)脂素基礎(chǔ)水平與抗環(huán)瓜氨酸肽抗體和RA 放射學(xué)進(jìn)展呈正相關(guān)。此外,在初治RA 患者中還觀察到血清內(nèi)脂素水平與疾病活動(dòng)性相關(guān)。有學(xué)者在RA 動(dòng)物模型中研究了內(nèi)脂素抑制劑FK866 的作用,發(fā)現(xiàn)通過藥理抑制消耗內(nèi)脂素可以降低RA 的嚴(yán)重程度和炎癥因子的分泌[19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,LPS 組的MH7A 細(xì)胞中內(nèi)脂素mRNA 水平以及細(xì)胞上清內(nèi)脂素蛋白水平均升高,而通過GSH干預(yù)可明顯下調(diào)細(xì)胞中內(nèi)脂素mRNA 以及細(xì)胞上清的內(nèi)脂素蛋白水平。NAD(P)+/NAD(P)H 和GSH/GSSG 是人體重要氧化還原對(duì),炎癥激活期間產(chǎn)生的ROS 可誘導(dǎo)細(xì)胞中的DNA 損傷,導(dǎo)致NAD+ 池的消耗,NAD+ 維持糖酵解通量和炎癥功能需要通過激活NAMPT 進(jìn)行補(bǔ)救[20]。而我們給予GSH 干預(yù),提高了細(xì)胞的抗氧化能力,降低了ROS 水平,從而下調(diào)了NAMPT 的表達(dá)。我們?cè)贑IA 大鼠模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了經(jīng)GSH 干預(yù),巨噬細(xì)胞中的內(nèi)脂素明顯下降。結(jié)合我們此前的研究結(jié)果——GSH 可下調(diào)MH7A細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMMP-3)等的表達(dá),我們推測(cè)GSH 可能部分通過降低內(nèi)脂素的表達(dá)從而調(diào)控炎癥。但其機(jī)制需要進(jìn)一步研究,深入探討GSH參與RA 發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制,有望為新型靶點(diǎn)藥物的研發(fā)提供新視角。