劉雙平，趙澤素，劉海坡，吳玉峰，毛健*

1(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(紹興)產(chǎn)業(yè)技術研究院，浙江 紹興，312000) 3(中國酒業(yè)協(xié)會，北京，100089)4(國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，312000)

紅曲酒是以糯米為原料，經(jīng)過蒸煮、拌曲、糖化發(fā)酵釀制而成的一種低度黃酒[1]。紅曲酒與其他黃酒最大的不同是以紅曲作為糖化發(fā)酵劑，從而使其酒味香醇、酯香濃厚、口感清冽爽口且酒體呈現(xiàn)獨特的棕紅色[2]。紅曲含有紅曲色素等次級代謝產(chǎn)物，賦予了酒體明亮的紅色[3]。

紅曲色素是一種天然色素，按顏色差異分為紅、橙、黃3大類。然而，由于紅曲色素對光、熱、pH等因素敏感[4]，極易發(fā)生降解，從而使紅曲酒褪色，導致貨架期縮短，品質降低。穩(wěn)定紅曲酒顏色是提高紅曲酒外觀品質的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)光照是影響紅曲酒色價不穩(wěn)定的首要因素[5]，特別是自然光和紫外線，使得紅色素比黃色素和橙色素降解更快[6]；避光下儲存紅曲酒，能夠一定程度上提高紅色價的穩(wěn)定性[5]。然而，實驗發(fā)現(xiàn)紅曲酒在長期避光儲藏過程中仍會發(fā)生顯著的褪色現(xiàn)象，目前關于紅曲酒在避光條件下導致色價降低的因素仍不清楚。

紅曲酒的釀造過程是一個復雜的系統(tǒng)，其色價穩(wěn)定性可能受有機酸、氨基酸等物質和煎酒溫度、儲存溫度、酒精度、氧氣、pH等工藝條件影響。為此，本研究探討了長期避光儲存條件下紅曲酒酒體物質及加工儲藏指標對紅曲酒色澤穩(wěn)定性的影響，以期為保護紅曲酒色澤提供科學方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲及紅曲酒樣品，福建漳州某紅曲酒工廠。

甲醇、乙腈、無水乙醇、氨基酸等(均為分析純)，國藥集團化學有限公司；酒石酸、乳酸、乙酸、兒茶素、沒食子酸、綠原酸等高效液相色譜和氣相色譜-質譜檢測使用的化學標準品，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外分光光度計，上海美普達儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters科技有限公司；安捷倫A1100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；氣相色譜質譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲酒的相關指標測定方法

常規(guī)理化指標的測定：還原糖、總酸、氨基態(tài)氮、酒精度參照GB/T 13662—2018《黃酒》進行測定。

有機酸含量和游離氨基酸含量參照劉蕓雅的方法[7]，采用HPLC法測定。

揮發(fā)性風味物質參照ZHOU等[8]的方法，采用GC-MS法測定。

1.3.2 紅曲酒中色價的測定

色價參照GB 1886.19—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲米》，采用紫外分光光度計法測定。

使用紫外可見分光光度計測定溶液在410、465、510 nm的吸光度，分別表示黃色素、橙色素、紅色素含量，以A410、A465、A510表示。色素保存率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，紅曲浸提液或紅曲酒儲存后吸光度；A0，紅曲浸提液或紅曲酒儲存前吸光度。

1.3.3 酒體本身指標對紅曲酒避光保存色價的影響

1.3.3.1 紅曲浸提液的制備

稱取一定量的紅曲按1∶10(g∶mL)的固液比溶于蒸餾水中，過濾后再重復浸泡3次，合并濾液即得紅曲浸提液。

1.3.3.2 pH值對紅曲酒色價的影響

分別用1 mol/L乳酸和1 mol/L NaHCO3溶液調整紅曲浸提液pH為3、4、5、6、7、8，之后將其靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率[9]。

1.3.3.3 有機酸、氨基酸、酚類化合物對紅曲酒色價的影響

分別調整紅曲浸提液成分3 g/L乙酸、3 g/L乳酸，3 g/L酒石酸、3 g/L檸檬酸、2 g/L 17種常見氨基酸、80 mg/L兒茶素、80 mg/L沒食子酸和80 mg/L綠原酸，裝入陶瓷瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.3.4 酒精度對紅曲酒色價的影響

用無水乙醇將紅曲浸提液的酒度調配成0%vol、5%vol、10%vol、15%vol、20%vol、28%vol、38%vol，之后裝入陶瓷瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.4 加工儲藏條件對紅曲酒避光保存色價的影響

1.3.4.1 灌裝溫度對紅曲酒色價的影響

將紅曲原酒分裝于陶瓷瓶中，密封保存，分別置于60、70、80、90、100 ℃下保溫60 min，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.4.2 貯藏溫度和時間對紅曲酒色價的影響

將陶瓷瓶裝的紅曲原酒分別置于4、25、37 ℃條件下避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.4.3 氧氣對紅曲酒色價的影響

將紅曲原酒分裝到外包錫箔紙的棕色補料瓶中，分別在厭氧(瓶中通入氮氣，氮吹2 min，排盡瓶內氧氣，取樣時一邊氮吹一邊取樣)和有氧(每隔2周通入10 mL空氣)條件下避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.5 提高紅曲酒色價穩(wěn)定性驗證實驗

用汗酒將紅曲酒酒度調到38%vol，裝到陶瓷瓶中，之后放入4 ℃冰箱中避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗得到的數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行Duncan’s差異顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。實驗均重復3次，所有指標的測定結果均以平均值±標準差表示，采用Origin 2018和GraphPad Prism8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 紅曲酒中色價的穩(wěn)定性分析

跟蹤福建漳州某紅曲酒工廠生產(chǎn)過程中紅曲酒色價變化(圖1)，發(fā)現(xiàn)紅曲酒煎酒前后紅曲酒色價損失為5.70%，可能是由于采用高溫短時煎酒工藝，色價損失較少。在隨后的陶瓷酒壇避光常溫儲存過程中，色價隨著儲存時間延長，顯著下降。180 d后，色價下降了64.10%，酒體顏色由初始的鮮紅色變?yōu)樽攸S色，褪色現(xiàn)象顯著。雖然采用了避光保存方法，紅曲酒色價仍然會顯著降低，說明除光照外，仍然存在使紅曲酒色價不穩(wěn)定的因素。由于在儲存過程中并未有人為因素干擾，研究人員分析導致紅曲酒色價不穩(wěn)定的主要因素應該包括紅曲酒的理化成分和工藝條件2個部分。

圖1 貨架期的紅曲黃酒的色價穩(wěn)定性Fig.1 Color stability of Hong Qu glutinous rice wine during shelf life

2.2 紅曲酒主要理化指標及其對避光儲存時色價的影響

2.2.1 紅曲酒主要理化指標

對市售紅曲酒理化指標分析發(fā)現(xiàn)，紅曲酒的pH為4～5，有機酸是導致其成酸性的主要因素。醋酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸和酮戊二酸是紅曲酒中的主要有機酸，占總量的86.10%，其中乳酸和乙酸比例最高，分別為28.16%和35.73%。有機酸是紅曲酒中重要的風味物質，適量的有機酸對紅曲酒的酸味起著不可或缺的作用，對酯類物質形成也有一定的促進作用[10]。

氨基酸是紅曲酒的主要營養(yǎng)成分之一，對紅曲酒的營養(yǎng)價值和風味形成有重要貢獻。市售紅曲酒中游離氨基酸總量為4.12 g/L，其中苦味氨基酸占比最高，占總量的54.87%，甜味氨基酸次之，為27.22%，而鮮味氨基酸和澀味氨基酸分別僅占總量的10.51%和7.40%，因此市售紅曲酒的苦味相對較多，鮮甜味較少?？偟膩碚f，其在口感上偏苦澀，鮮甜味較少。

表1 市售紅曲酒的主要理化指標Table 1 Main physical and chemical indexes of Hong Qu glutinous rice wine sold in market

揮發(fā)性風味物質是形成紅曲酒香氣的重要成分，紅曲黃酒中的揮發(fā)性風味物質主要包括醇類、酸類、醛類、酯類、酚類等，實驗中檢測到了14種酯類、4種醇類、4種酸類、6種醛類和5種酚類物質。酯類含量較高，是最主要的風味物質，占其總量的61.75%；而酚類物質占總量的12.82%，是紅曲酒中重要的抗氧化成分，已有研究證明酚類能夠保護色素[11]。

2.2.2 pH對避光儲存時色價的影響

由于紅曲酒中有機酸大部分為乳酸，通過添加乳酸將紅曲浸提液調整到不同pH，避光保存90 d。結果表明，紅曲色素對pH的耐受性較好，3種色素色價均在70%以上(圖2-a)。當pH 7時，色素保存率相對較好，均在90%左右，這與張帝[9]、鄭虹等[12]對紅曲色素結論一致。當pH為4～9時，黃色素的保存率均在90%以上，當pH 3的強酸環(huán)境下，黃色素保存率略微下降，但仍在85%以上，說明pH在3～9范圍內對黃色素的穩(wěn)定性幾乎無明顯影響。綜上，pH對紅曲酒色價穩(wěn)定性影響不大。

2.2.3 有機酸、氨基酸、多酚對避光儲存時色價的影響

紅曲酒體系組成較為復雜，其主要成分有機酸、氨基酸、多酚是否會影響紅曲黃酒顏色穩(wěn)定性，尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸、乙酸的添加均會降低紅曲酒色價穩(wěn)定性(圖2-b)，添加了乳酸、乙酸的紅曲浸提液避光儲存90 d后紅色素保存率為35.71%和36.22%，與對照相比，紅色素的穩(wěn)定性分別降低了13.58%和11.59%。在避光條件下，乙酸、乳酸、酒石酸、檸檬酸對溶液的顏色穩(wěn)定性影響較大，且溶液中有明顯的沉淀，這可能是由于酸加速了水與色素的相互作用，例如酯鍵斷裂[13]，從而影響了紅曲酒顏色的穩(wěn)定性。

添加了兒茶素、沒食子酸、綠原酸的紅曲浸提液避光儲存90 d后紅色素保存率分別為58.97%、51.51%、49.68%(圖2-c)，顯著高于對照組，而橙黃色素的保存率與對照組沒有明顯差異，說明多酚化合物對紅色素有一定的保護作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，紅曲原酒中添加綠茶提取物，能夠有效提高紅曲酒陳釀過程中的色價穩(wěn)定性[14]，結合本研究結果，分析原因可能是綠茶中的兒茶素等茶多酚含量較高，緩解了色價降低[15]。然而，茶葉中含有大量的咖啡堿等使機體興奮的化合物[16]，加上紅曲酒中酒精的刺激[17]，茶葉紅曲黃酒飲用后可能導致頭疼、斷片等宿醉問題。

另外，單獨添加氨基酸中的甘氨酸或組氨酸后，紅色價的穩(wěn)定性分別提高了8.94%或6.99%，但整體添加17種游離氨基酸對避光保存90 d的紅曲酒色價沒有顯著影響。

2.2.4 酒精度對避光儲存時色價的影響

紅曲酒避光存放90 d后，酒度為5%vol時，紅色價和黃色價的保存率顯著降低(圖2-d)，但隨著酒度的提高(5%vol～38%vol)，3種色價的保存率均顯著升高。表明了隨酒度的升高，紅曲酒的顏色穩(wěn)定性更高。同時，在光照條件下，也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，如酒度的增大提高了梔子黃色素的色價穩(wěn)定性，降低了紫外光對紅曲紅色價的破壞[18]。生產(chǎn)中可以采用添加紅曲酒副產(chǎn)物-汗酒來提高紅曲酒酒度，從而提高產(chǎn)品顏色的穩(wěn)定性。

綜上，研究發(fā)現(xiàn)酒體物質中有機酸、pH對紅曲酒顏色穩(wěn)定雖有一定影響，但效果不大；酒精度對提高紅曲酒的色價穩(wěn)定性最有效，其次是多酚化合物和氨基酸。

a-pH值；b-有機酸；c-多酚；d-酒精度圖2 避光條件下儲存90 d后酒體成分及理化指標對紅曲酒色價的影響Fig.2 Effects of wine composition and physical and chemical indexes on color value of Hong Qu glutinous rice wine after 90 days of storage under dark conditions注：原酒為新壓榨的紅曲酒；對照為儲存90 d后的原酒，不同小寫字母表示不同色價有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.3 加工貯藏條件對紅曲酒色價的影響

2.3.1 灌裝溫度對避光儲存時色價的影響

黃酒殺菌普遍采用熱殺菌工藝，故又稱為“煎酒”，其煎酒溫度一般為85～93 ℃[19]。黃酒生產(chǎn)采用熱灌裝，灌瓶殺菌后大量酒堆積在一起，酒體降溫較慢，因此本研究適當延長了灌裝后的觀測時間至60 min，以評估紅曲酒灌瓶后緩慢降溫過程對色價的影響。當溫度≤60 ℃時，紅曲色素的穩(wěn)定性較好(圖3-a)，紅曲酒中的紅色價保存率為94.63%，同時橙色素和黃色素保存率分別為93.10%和98.25%；當溫度>70 ℃時，隨著溫度升高，色素降解的趨勢也顯著加快；當煎酒溫度為80 ℃時，紅曲酒中的紅色素、橙色素和黃色素保存率分別為80.45%、85.41%、96.60%，當溫度達到100 ℃時，紅曲酒中的紅色價、橙色價和黃色價保存率分別為68.60%、76.09%、92.06%?？梢?，經(jīng)過不同條件的加熱處理，紅曲色素中的紅色素和橙色素穩(wěn)定性均受到了破壞，隨著灌瓶溫度的提高，其降解程度加大，而黃色素在受熱條件下保存率較高，這可能是因為紅色素、橙色素由于長時間受熱，結構發(fā)生了變化，并向黃色素結構轉變，導致紅曲酒的棕紅色逐漸變淺，酒體逐漸呈黃色[20]，但黃色素在熱處理過程中不飽和酮結構和鏈狀共軛雙鍵均會消失，降解產(chǎn)物為無色[21]，因此隨著儲存時間的進一步延長，紅曲酒的黃色將逐漸褪成無色。

2.3.2 貯藏溫度和時間對避光儲存時色價的影響

結合紅曲酒在實際生產(chǎn)流通過程中的情況，本研究將紅曲酒分別在4、25、37 ℃下避光存放，每隔一定時間測定色價。避光儲存90 d后，4 ℃下紅色價、橙色價和黃色價的保存率分別為69.19%、74.82%和78.12%(圖3-b)，25和37 ℃下色價保存率均顯著降低，尤其是紅色價保存率分別僅為45.95%和34.69%，說明避光條件下，室溫儲存是導致色價降低的主要因素，低溫(<4 ℃)儲運是保證紅曲酒色價穩(wěn)定性的有效方式。多數(shù)天然色素對熱敏感，如花青素[22]和蘿卜藍色素[23]。研究發(fā)現(xiàn)紅曲黃色素的熱降解與光降解機制不同，黃色素在光照下褪色是因為α,β-不飽和酮結構的助色基團消失，而熱降解是因為生色基團α,β-不飽和酮結構及共軛雙鍵均受到破壞，顏色直接消失[21]，橙色素在光照下褪色是由于其發(fā)生了電子能級躍遷，提高了光降解能量，從而加快褪色，紅色素的光降解機制與黃色素一致[24]，然而關于紅色素和橙色素熱降解機制仍有待探索。

a-灌裝溫度；b-氧氣及儲存溫度圖3 避光條件下儲存90 d后加工儲存條件對 紅曲酒色價的影響Fig.3 Influence of processing and storage conditions on color value of Hong Qu glutinous rice wine after 90 days of storage under dark conditions

2.3.3 氧氣對避光儲存時色價的影響

紅曲酒在陶壇儲存過程中，陶壇壁微孔能夠緩慢滲入氧氣，促進酒體陳化，但尚不清楚氧氣是否能夠影響紅曲酒避光儲存過程中顏色的穩(wěn)定性。通過定時通入定量氧氣，研究了氧氣對不同儲存溫度(4、25、37 ℃)下紅曲酒色價的影響(圖3-b)。發(fā)現(xiàn)氧氣不影響紅曲酒色價穩(wěn)定性，與徐海笑等[21]研究類似。

2.4 提高紅曲酒色價穩(wěn)定性的策略

通過對紅曲酒成分以及加工儲藏條件的分析，發(fā)現(xiàn)pH、有機酸、溫度和氧氣影響了紅曲酒顏色穩(wěn)定性，其中，溫度是影響紅曲酒顏色穩(wěn)定性的首要因素，灌裝溫度比儲存溫度對紅曲酒色價穩(wěn)定影響大；而氨基酸、多酚、乙醇可以延緩紅曲酒色素降解，前兩者雖起到了一定作用，但作用遠不如酒精度。

雖然紅曲酒生產(chǎn)采用高溫殺菌，但高溫瞬時殺菌裝備、超高溫瞬時滅菌等裝備的出現(xiàn)，能夠有效縮短殺菌時間，從而避免煎酒對色價的破壞。儲運過程雖然溫度低，但時間長，是導致紅曲酒色價降低的主要原因。根據(jù)上述研究結論，提出提高酒度、降低儲存溫度的紅曲酒生產(chǎn)方式(圖4)。通過汗酒調整酒度為38%vol，在4 ℃下避光存放90 d后的色素保存率為91.27%，是單獨4 ℃下儲存的1.25倍，是現(xiàn)有室溫存放的2.27倍；存放120 d后，其色素保存率為87.73%，是單獨4 ℃下儲存的1.23倍，是現(xiàn)有室溫存放的2.32倍。因此，高酒度低溫儲存是保護紅曲酒色價穩(wěn)定性的有效方法。

圖4 避光條件下紅曲酒在不同酒度和溫度下色價穩(wěn)定性Fig.4 Color stability of Hong Qu glutinous rice wine at different temperatures under the condition of avoiding light

3 結論

紅曲酒在貨架期的顏色穩(wěn)定對于其在食品行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本文研究了避光條件下不同因素對紅曲黃酒顏色穩(wěn)定性的影響。研究結果表明，避光儲存條件下，各因素對色價的降解能力分別是：灌裝溫度>儲存溫度>pH>有機酸>氧氣；而對紅曲酒顏色穩(wěn)定性的提高能力分別是4 ℃儲存>酒精度>多酚成分>氨基酸。

雖然灌裝溫度對紅曲酒的影響最大，但因高溫灌裝殺菌是一個必要的過程，因此可以通過控制儲存溫度和酒度來使紅曲酒色價保持穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)4 ℃儲存對紅曲酒的護色效果最好。此外，紅曲酒煎酒產(chǎn)生的副產(chǎn)物汗酒可以用來提高酒度，既可省去黃酒滅菌這一過程，同時還可將副產(chǎn)物加以利用，節(jié)約資源。因此，綜合考慮，紅曲酒過濾完后加入汗酒調節(jié)酒度到38%vol，之后放入4 ℃條件下儲存以達到護色的效果。

汗酒的使用可以有效提高紅曲酒副產(chǎn)物的附加值，4 ℃冷藏存放工藝在黃酒行業(yè)內業(yè)已成熟，如張家港釀酒有限公司、會稽山紹興酒股份有限公司均已采用冷藏儲酒，相關技術可快速在紅曲酒行業(yè)推廣。