黃曉明,陳勇,牛會(huì)敏

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系,福建福州 350007;2.廈門(mén)大學(xué)附屬東方醫(yī)院福建省適配體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350025;3.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,福建福州 350025)

癌癥是導(dǎo)致死亡率最高的疾病之一,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和社會(huì)的發(fā)展。通過(guò)對(duì)癌癥的有效早期診斷,可以盡早進(jìn)行治療以降低癌癥的病死率。盡管癌癥早期診斷技術(shù)近年來(lái)有了很大的進(jìn)展,但這些方法大多存在侵入性、特異性低、靈敏度低、技術(shù)要求高、成本高等局限。因此,尋找新的癌癥早期診斷方法迫在眉睫。近年來(lái),已有研究發(fā)現(xiàn)核酸適配體(Aptamer)具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu),可特異性地結(jié)合各種靶標(biāo),具有分子量小、合成簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、免疫原性小等優(yōu)點(diǎn),展現(xiàn)出傳統(tǒng)的免疫學(xué)分子和化學(xué)分子識(shí)別所無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì),被視作可替代單克隆抗體的新型分子,在癌癥診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本文介紹核酸適配體在幾種常見(jiàn)癌癥診斷中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 核酸適配體概述

核酸適配體是長(zhǎng)度為20～80個(gè)核苷酸的單鏈DNA或RNA,由于分子內(nèi)相互作用而折疊成獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu),能夠以高親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)[1-3]。通常是利用體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),從核酸分子文庫(kù)中得到寡核苷酸片段。自從SHANGGUAN等[4]首次開(kāi)發(fā)了一種基于指數(shù)富集的全活細(xì)胞配體選擇新方法Cell-SELEX以來(lái),適配體選擇的靶標(biāo)范圍從無(wú)機(jī)分子[5]、有機(jī)分子[6]、生物大分子[7]擴(kuò)展到全活細(xì)胞[8]。

核酸適配體是基于核苷酸之間嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別能力和親和力而設(shè)計(jì)的人工合成寡核苷酸,其特性十分類(lèi)似于單克隆抗體的功能。與抗體相比,核酸適配體具有高特異性[9]、低毒性[10]、低成本[11]、易于合成[12]、易修飾[13]和低免疫原性[14]等優(yōu)點(diǎn)。與此同時(shí),核酸適配體在結(jié)合親和力方面也可與抗體競(jìng)爭(zhēng),解離常數(shù)(Kd)可達(dá)pM水平[15]。此外,核酸適配體具有高度特異性,可以區(qū)分僅因小分子[16]中的一個(gè)甲基而不同的靶標(biāo),或大蛋白[17]中的一個(gè)氨基酸而不同的靶標(biāo)。

核酸適配體作為一類(lèi)新型識(shí)別分子,目前已發(fā)展成為備受關(guān)注的新型檢測(cè)工具,廣泛應(yīng)用于癌癥的早期診斷,并顯示出巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

2 核酸適配體在癌癥診斷中的應(yīng)用

2.1 在胃癌診斷中的應(yīng)用胃癌是全球癌癥死亡的主要原因之一。盡管診斷方法不斷改進(jìn),但到目前為止,尚未實(shí)現(xiàn)早期檢測(cè),而提高胃癌的早期診斷水平將有助于早期胃癌患者的良好預(yù)后。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在液體活檢中是腫瘤診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。然而,循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)與胃癌之間的關(guān)系卻鮮有定量研究。LI等[18]提出了一種簡(jiǎn)單、低成本、雙適配體(EpCAM和PTK7)修飾的免疫磁性Fe3O4顆粒(IMNs),用于胃癌患者異質(zhì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效捕獲和下游分析。原發(fā)性胃癌組織中可見(jiàn)PTK7高表達(dá),且PTK7與EpCAM表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。以MGC-803和BGC-823細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞模型,獲得的雙靶向IMNs能夠區(qū)分高表達(dá)或低表達(dá)EpCAM和PTK7的細(xì)胞,提高了胃癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞識(shí)別的準(zhǔn)確性。此研究為進(jìn)一步開(kāi)展循環(huán)腫瘤細(xì)胞相關(guān)診斷和個(gè)體化治療的研究提供了重要參考。

外泌體是一種直徑為30～150 nm的納米囊泡,具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu),可以被各種細(xì)胞分泌并釋放到各種體液中,包括尿液、血液、眼淚、精液等,是液體活檢的理想對(duì)象。許多外泌體蛋白質(zhì)和miRNA被認(rèn)為是潛在的癌癥生物標(biāo)志物,對(duì)外泌體進(jìn)行液體活檢在癌癥的早期診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估方面引起了廣泛關(guān)注。HUANG等[19]開(kāi)發(fā)了一種基于分支滾圈擴(kuò)增(BRCA)和靶向特異性外泌體的適配體的胃癌外泌體熒光檢測(cè)方法,該方法對(duì)目標(biāo)外泌體具有較高的特異性,檢出限為4.27×104/mL,這種基于適配體的生物傳感器在胃癌的早期診斷中具有潛力。HUANG等[20]提出了一種無(wú)標(biāo)簽的電化學(xué)適配體傳感器,用于胃癌外泌體的特異性檢測(cè)。該平臺(tái)包含抗CD63抗體修飾金電極和胃癌外泌體特異性適配體,該適配體傳感器對(duì)胃癌外泌體具有較高的選擇性和敏感性,檢出限為9.54×104/mL。雖然基于外泌體的液體活檢已被應(yīng)用于包括癌癥在內(nèi)的疾病的診斷和監(jiān)測(cè),但基于代謝水平的外泌體的疾病檢測(cè)鮮有報(bào)道。CHEN等[21]構(gòu)建了特異的核酸修飾體耦合的金修飾多態(tài)碳(CoMPC@Au-Apt),用于捕獲早期胃癌患者和健康對(duì)照者的尿液外泌體,并在無(wú)需額外洗脫過(guò)程的情況下進(jìn)行后續(xù)的外泌體代謝模式分析,這項(xiàng)研究說(shuō)明了外泌體的高特異性和外泌體代謝分析在胃癌的早期診斷和監(jiān)測(cè)中具有廣闊前景。

2.2 在肺癌診斷中的應(yīng)用肺癌是世界上最常見(jiàn)和最致命的癌癥。肺癌患者預(yù)后較差,早期診斷和治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。目前已經(jīng)發(fā)展出幾種檢測(cè)肺癌的常規(guī)方法,但這些方法大多成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低,而且還需要精密儀器[22-23]。為了克服這些因素,需要開(kāi)發(fā)新的方法和試劑以實(shí)現(xiàn)肺癌的早期診斷。

BASHMAKOVA等[24]建立了一種基于一對(duì)適配體作為敏感元素和重組Ca2+調(diào)控光蛋白傳感元件作為高靈敏度生物發(fā)光報(bào)告的固相分析方法,用于檢測(cè)血液中循環(huán)的肺腫瘤元素。ZHAO等[25]使用了一種新的改良SELEX,稱(chēng)為血清-SELEX,分離出可以特異性結(jié)合肺癌血清的適配體,而無(wú)需事先了解其靶點(diǎn),該適配體在肺癌早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。CHEN等[26]設(shè)計(jì)了一個(gè)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的延伸聚合適配體探針(TEPAP),該探針具有較高的靈敏性,能特異性識(shí)別NCI-H446細(xì)胞,在小細(xì)胞肺癌診斷中具有很大的潛力。

基于外泌體的體外液體活檢為快速、可靠地檢測(cè)肺癌提供了良機(jī)。ZHAO等[27]提出了一種結(jié)合功能化膜的自動(dòng)化離心微流體盤(pán)系統(tǒng)(Exo-CMDS)分離和富集外泌體,然后通過(guò)一種新型的適配體熒光系統(tǒng)(Exo-AFS)處理外泌體表面蛋白,從而有效地檢測(cè)外泌體表面蛋白。與傳統(tǒng)技術(shù)相比,Exo-CMDS和Exo-AFS具有成本低、速度快、純度高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),為肺癌早期檢測(cè)提供一種切實(shí)可行的方法。

2.3 在乳腺癌診斷中的應(yīng)用乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的癌癥,早期檢測(cè)對(duì)于改善預(yù)后和降低病死率至關(guān)重要。越來(lái)越多的研究表明,外泌體作為許多癌癥的早期診斷生物標(biāo)志物和調(diào)節(jié)因子有很大的潛力。ESPOSITO等[28]開(kāi)發(fā)了一種新的差異SELEX策略,稱(chēng)為Exo-SELEX,通過(guò)選擇一組抗核酸酶序列,優(yōu)化了一個(gè)高親和力適配體(ex-50.T),使其能夠特異性識(shí)別乳腺癌細(xì)胞或患者血清樣本中的外泌體。

乳腺癌的分子分型因其在個(gè)性化治療和預(yù)后方面的潛力而備受關(guān)注。然而,目前的方法不能用于精確的分型,因此在臨床實(shí)踐中提出了挑戰(zhàn)。LIU等[29]開(kāi)發(fā)一種基于細(xì)胞特異性單鏈DNA(ssDNA)適配體的熒光探針,通過(guò)改進(jìn)的Cell-SELEX方法對(duì)乳腺癌進(jìn)行精確的分子分型。適配體sk6Ea對(duì)SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞具有較高的特異性,不僅能在體外和體內(nèi)區(qū)分乳腺癌分子亞型,而且與其他和乳腺癌相關(guān)的適配體相比,還能將SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞與其他癌細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。這種基于適配體的探針是一種快速、高靈敏度的乳腺癌分子分型工具,在乳腺癌分子分型的鑒別、診斷和靶向治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用結(jié)直腸癌(CRC)是人類(lèi)最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一。和大多數(shù)癌癥一樣,結(jié)直腸癌的存活率在很大程度上取決于疾病診斷階段。PU等[30]使用熒光標(biāo)記的抗EpCAM 19 DNA適配體(SYL3C-CY3)作為一種有效的分子探針,開(kāi)發(fā)了一種基于適配體的免疫熒光方法,用于診斷來(lái)自結(jié)直腸癌患者的組織樣本中的EpCAM20陽(yáng)性結(jié)直腸癌細(xì)胞。MAIMAITIYIMING等[31]基于細(xì)胞的SELEX方法篩選一種高親和力DNA適配體,能夠選擇性靶向結(jié)直腸癌Caco-2細(xì)胞。WANG等[32]基于氧化石墨烯(GO)-DNA適配體(CD63和EpCAM適配體)相互作用,開(kāi)發(fā)了一種DNase I酶輔助熒光擴(kuò)增結(jié)直腸癌外泌體檢測(cè)方法。

早期診斷轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)對(duì)改善治療和延長(zhǎng)生存期至關(guān)重要。CHEN等[33]設(shè)計(jì)了一種基于氧化石墨烯的熒光適配體傳感器(FAM-W3-GO),用于無(wú)需洗滌流程的mCRC細(xì)胞的一步敏感檢測(cè)。在分析過(guò)程中,GO與FAM-W3結(jié)合,淬滅FAM的熒光。當(dāng)靶細(xì)胞加入后,隨著FAM-W3的釋放,綠色熒光會(huì)恢復(fù)。因此,一種用于mCRC細(xì)胞檢測(cè)的高靈敏度適配體傳感器是通過(guò)靶細(xì)胞有無(wú)時(shí)的熒光變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于對(duì)W3的特異性識(shí)別,FAM-W3-GO可用于復(fù)雜環(huán)境下mCRC細(xì)胞的檢測(cè),檢測(cè)程序簡(jiǎn)單,無(wú)需洗滌步驟即可實(shí)現(xiàn)一步定向檢測(cè)。

2.5 在前列腺癌診斷中的應(yīng)用前列腺癌(PCa)是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一,也是許多國(guó)家男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因。早期診斷對(duì)于PCa的治療和預(yù)后非常重要。GU等[34]利用聚乙二醇(PEG)和抗PSMA適配體修飾多壁碳納米管(MWCNTs),研制了一種新型納米聲造影劑。結(jié)果表明,與傳統(tǒng)造影劑相比,改進(jìn)的多壁碳納米管具有更好的可視性和準(zhǔn)確性,能夠更有效地靶向前列腺癌細(xì)胞。ABRAHAM等[35]開(kāi)發(fā)了一種與腫瘤特異性靶向DNA適配體生物偶聯(lián)的鈣-磷硅酸鹽納米顆粒,也稱(chēng)為納米外套(NJs),用以增強(qiáng)前列腺癌的近紅外熒光成像,以提高早期癌癥的檢測(cè)。HASSANI等[36]使用絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)修飾金納米顆粒(Au NPs)偶聯(lián)硫?；m配體,設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、高靈敏度、經(jīng)濟(jì)的無(wú)標(biāo)簽電化學(xué)適配體傳感器,用于前列腺特異性抗原(PSA)的檢測(cè)(PSA是前列腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物),該法提供了準(zhǔn)確、可重復(fù)和高靈敏度的臨床血清樣本PSA最低水平的測(cè)定。

2.6 在其他癌癥診斷中的應(yīng)用除上述癌癥外,基于核酸適配體的檢測(cè)技術(shù)在其他人類(lèi)常見(jiàn)癌癥診斷中也被廣泛應(yīng)用。ZHAO等[37]制備了一種基于磷脂酰肌醇-3(GPC3)適配體介導(dǎo)的超微超順磁性氧化鐵(USPIO)的靶向MRI分子探針,結(jié)果證實(shí)了該探針對(duì)表達(dá)GPC3的肝癌具有靶向成像作用。WANG等[38]以宮頸癌為模型,采用Cell-SELEX方法,以正常上皮細(xì)胞為對(duì)照進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)了一種特異性與宮頸癌細(xì)胞高親和力結(jié)合的DNA適配體C-9S,該適配體具有成為宮頸癌早期檢測(cè)、體內(nèi)成像和靶向傳遞進(jìn)一步研究的分子探針的巨大潛力。TSAI等[39]設(shè)計(jì)了一種集成微流體系統(tǒng),使用CX-BG1-10-A適配體檢測(cè)卵巢癌源性BG-1細(xì)胞,檢測(cè)步驟包括紅細(xì)胞裂解、白細(xì)胞耗盡和循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離,這使其比基于抗體的檢測(cè)系統(tǒng)更加敏感。KIM等[40]報(bào)道了一種EN2特異性適配體,以及一種靈敏且特異的酶聯(lián)寡核苷酸測(cè)定法(ELONA),該法依靠適配體介導(dǎo)的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)生成DNA納米結(jié)構(gòu),結(jié)合EN2并同時(shí)放大信號(hào),用于膀胱癌生物標(biāo)志物EN2的快速靈敏比色檢測(cè)。GAO等[41]開(kāi)發(fā)了一種基于適配體的癌胚抗原(CEA)微芯片電泳分析方法,該方法將CEA的特定適配體及其互補(bǔ)鏈與磁珠結(jié)合。在CEA存在的情況下,互補(bǔ)鏈從珠子中釋放出來(lái),然后與另一個(gè)FAM標(biāo)記的DNA結(jié)合,開(kāi)始信號(hào)傳遞過(guò)程。該方法對(duì)CEA具有較高的敏感性和特異性,檢出限為68 pg/mL,表明基于適配體的檢測(cè)方法可顯著提高胰腺癌的早期診斷率。

3 總結(jié)與展望

核酸適配體作為一類(lèi)新型檢測(cè)工具,已被廣泛應(yīng)用于多種癌癥的早期診斷。但目前核酸適配體在實(shí)際應(yīng)用方面還有諸多問(wèn)題需要解決,例如,在生物體液中發(fā)現(xiàn)大量核酸酶可以降解核酸適配體,且核酸適配體在體內(nèi)半衰期較短,因此,有必要設(shè)計(jì)更加穩(wěn)定的核酸適配體,以防止核酸酶的裂解。此外,核酸適配體的本質(zhì)是一段寡核苷酸,對(duì)其毒性研究實(shí)驗(yàn)很少,對(duì)人體是否會(huì)產(chǎn)生不良影響還有待進(jìn)一步研究。