王杉杉,張圓圓

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科,河南開封475004)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮的婦科癌癥。近年來,隨著人們壓力和生活方式的改變,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐漸增加[1]。盡管子宮切除可治療子宮內(nèi)膜癌,但子宮內(nèi)膜癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍影響患者預(yù)后[2-3]。尋找子宮內(nèi)膜癌相關(guān)標(biāo)志物預(yù)測疾病發(fā)展的臨床特征同時為今后治療提供可能的治療靶點值得關(guān)注。長鏈非編碼RNA生長阻滯特異性基因6反義RNA 1(long noncoding RNA growth arrest specific 6 antisense RNA 1,lncRNA GAS6-AS1)是一種長鏈非編碼RNA,在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移中扮演關(guān)鍵作用[4-5]。ZHANG等[6]研究顯示lncRNA GAS6-AS1在胃癌組織中上調(diào),且高表達(dá)GAS6-AS1可通過促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期來提升胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。但目前l(fā)ncRNA GAS6-AS1在子宮內(nèi)膜癌的作用研究尚不知曉。本文擬探討子宮內(nèi)膜癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA GAS6-AS1表達(dá)變化,并分析其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系,期望日后可為評估子宮內(nèi)膜癌預(yù)后提供有價值的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2015年6月至2018年1月于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院行子宮切除的80例子宮內(nèi)膜癌患者,患者年齡35～76歲,平均(54.18±11.67)歲;在子宮切除術(shù)中收集子宮內(nèi)膜癌組織以及距離癌組織邊緣5 cm以上的癌旁組織,組織樣品獲取后迅速置于液氮冷凍、備用。收集的子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織均經(jīng)病理實驗證實。納入標(biāo)準(zhǔn):①均行手術(shù)治療,經(jīng)病理檢查確診為子宮內(nèi)膜癌;②術(shù)前未進(jìn)行激素藥物治療、局部或全身化療、放療;③首次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn):①患其他腫瘤、肝腎功能障礙;②合并急慢性炎癥、其他婦科疾病;③患全身感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病;④子宮、卵巢雙發(fā)癌,無法確定原發(fā)病灶。本研究通過河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 檢測子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA GAS6-AS1表達(dá)水平將獲得的組織放入研缽中研磨,加入TRIzol試劑(武漢科昊佳生物科技有限公司)裂解組織,倒入EP管中,加入等體積的氯仿振蕩混勻,然后離心(14 000 r/min,30 min),收集上層上清移入新的無RNA酶的EP管中,加入等體積的異丙醇然后離心(12 000 r/min,25 min),收集沉淀,加入1 mL的無水乙醇懸浮沉淀,然后離心(14 000 r/min,20 min),得到RNA,加入DEPC水在4 ℃溶解RNA。依據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(南京賽泓瑞生物科技有限公司)說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板,采用7300型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)對lncRNA GAS6-AS1及內(nèi)GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,30 s;40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù),并對所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析,用2-CT法計算lncRNA GAS6-AS1相對表達(dá)量。lncRNA GAS6-AS1、GAPDH引物由南京金斯瑞生物工程有限公司合成,引物設(shè)計見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 隨訪從子宮內(nèi)膜癌患者手術(shù)切除術(shù)后以電話或門診方式隨訪,隨訪內(nèi)容包括婦科盆腔檢查、陰道B超、胸部X線檢查,必要時行CT或磁共振成像檢查。最長隨訪時間為5年,隨訪至2021年12月,記錄患者生存時間、總生存期(overall survival,OS),OS為開始治療到死亡或失訪的時間。預(yù)后不良包括患者死亡。80例子宮內(nèi)膜癌患者,存在33例刪失數(shù)據(jù)。

1.4 治療方法Ⅱ期、Ⅲ期子宮內(nèi)膜癌患者化療方案:(135～175 mg/m2)的紫杉醇(國藥準(zhǔn)字:H20063787,悅康藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)溶于500 mL生理鹽水中,靜脈滴入,d1;300 mg/m2的卡鉑(國藥準(zhǔn)字:H10950273,云南植物藥業(yè)有限公司)溶于500 mL生理鹽水中,靜脈滴入,d2;21 d為一個療程,治療4個療程。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA GAS6-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平與癌旁組織相比,子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA GAS6-AS1相對表達(dá)水平較高(P<0.001)。見表2。

表2 lncRNA GAS6-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平

2.2 lncRNA GAS6-AS1表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系手術(shù)病理分期參照2009年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)[7],Ⅰ期+Ⅱ期52例,Ⅲ期28例;浸潤深度≥1/2肌層33例,浸潤深度<1/2肌層47例;盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例,無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例;組織學(xué)分級:G1+G2 56例,G3 24例;病理分型:激素依賴型44例,非激素依賴型36例。根據(jù)lncRNA GAS6-AS1平均值(2.76)為截斷值,將子宮內(nèi)膜癌組織分為高表達(dá)組44例,低表達(dá)組36例,分析結(jié)果顯示浸潤深度≥1/2肌層、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA GAS6-AS1表達(dá)水平高于浸潤深度<1/2肌層、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌組織(P<0.05)。見表3。

表3 lncRNA GAS6-AS1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA GAS6-AS1相對表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示,lncRNA GAS6-AS1低表達(dá)組5年累積總生存率為83.10%,平均生存期為(56.11±1.50)個月(95%CI:53.16～59.06),高表達(dá)組5年累積總生存率為60.00%,平均生存期為(47.44±2.58)個月(95%CI:42.38～52.50),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank=5.616,P=0.018)。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜癌患者5年隨訪期間Kaplan-Meier生存曲線

2.4 影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險因素分析以子宮內(nèi)膜癌患者5年預(yù)后為因變量(預(yù)后不良=0,預(yù)后良好=1),將年齡(<60=0,≥60=1)、分化程度(高中分化=0,低分化=1)、FIGO分期(Ⅰ+Ⅱ=0,Ⅲ=1)、浸潤深度(<1/2肌層=0,≥1/2肌層=1)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0,有=1)、lncRNA GAS6-AS1表達(dá)水平(低表達(dá)=0,高表達(dá)=1)作為自變量并賦值進(jìn)行分析,單因素分析表明,浸潤深度、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA GAS6-AS1均是影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的危險因素。多因素分析表明,浸潤深度≥1/2肌層、lncRNA GAS6-AS1高表達(dá)是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險因素分析

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是威脅女性生命的常見惡性腫瘤,其患者病死率僅次于卵巢癌和宮頸癌[8-9]。子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移途徑包括侵襲周圍正常組織或通過血管、神經(jīng)及淋巴管侵襲遠(yuǎn)處器官[10]。臨床上除了手術(shù)治療子宮內(nèi)膜癌,還可用放療、化療等輔助治療策略,但晚期子宮內(nèi)膜癌患者治療方案有限,導(dǎo)致預(yù)后較差。因此研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)展機(jī)制,對尋找新的治療策略、改善患者預(yù)后有重要意義。

lncRNA是一種新型非編碼RNA,在不同組織中均有表達(dá),其在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及染色質(zhì)重塑中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[11-12]。以往的研究顯示,lncRNA在惡性腫瘤的發(fā)生中起關(guān)鍵作用,可作為癌癥診斷、預(yù)后評估的生物標(biāo)志物[13-14]。GAS6主要由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,具有與維生素K相關(guān)的γ-羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)域,通過該結(jié)構(gòu)域與包含磷脂酰絲氨酸的蛋白質(zhì)相互作用。GAS6的這種功能可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生殖過程、血管生成過程和免疫反應(yīng)過程。研究顯示,在胰腺癌中GAS6表達(dá)水平降低會阻止腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并激活自然殺傷細(xì)胞,從而阻礙腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15]。GAS6-AS1是GAS6的反義方向轉(zhuǎn)錄。LAVASANI等[16]研究顯示,GAS6-AS1可通過激活GAS6而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性。LEI等[17]研究顯示,GAS6-AS1在急性髓系白血病骨髓細(xì)胞中呈高表達(dá),高表達(dá)GAS6-AS1可促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞遷移和侵襲,為治療急性髓系白血病提供了新的治療靶點。CHEN等[18]通過實時定量PCR檢測結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中GAS6-AS1表達(dá)水平,結(jié)果顯示,GAS6-AS1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平均上調(diào),并與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān),另外,GAS6-AS1可通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)和FUS依賴性方式促進(jìn)TRIM14介導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,提示GAS6-AS1可作為結(jié)直腸癌新的生物標(biāo)志物和治療靶點。本研究顯示子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA GAS6-AS1表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,且浸潤深度≥1/2肌層、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA GAS6-AS1表達(dá)水平高于浸潤深度<1/2肌層、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織,提示lncRNA GAS6-AS1參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究Kaplan-Meier生存曲線顯示,lncRNA GAS6-AS1低表達(dá)組子宮內(nèi)膜癌患者5年累積總生存率高于lncRNA GAS6-AS1高表達(dá)組,提示lncRNA GAS6-AS1可能影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后,本研究結(jié)果與CHEN等[18]研究報道類似,表明lncRNA GAS6-AS1高表達(dá)可能對子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的預(yù)測有貢獻(xiàn)。推測lncRNA GAS6-AS1影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的可能原因是lncRNA GAS6-AS1可調(diào)控子宮內(nèi)膜癌遷移和侵襲。本研究還發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS1高表達(dá)是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素,提示lncRNA GAS6-AS1可能是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良發(fā)生的影響因素。

綜上所述,子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA GAS6-AS1呈高表達(dá),與子宮內(nèi)膜癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度密切相關(guān),lncRNA GAS6-AS1高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良有關(guān),有望成為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的生物學(xué)指標(biāo)。但本研究也有不足,納入樣本量有限,研究中心單一,后續(xù)仍需增加樣本量驗證lncRNA GAS6-AS1與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系,并深入探討lncRNA GAS6-AS1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生機(jī)制及預(yù)后不良機(jī)制的關(guān)系。