金麗瓊，張 睿，劉 妤，楊 靜

(甘肅省分析測試中心,甘肅蘭州 730000)

己烯雌酚是添加在飼料中促進魚類的生長屬激素類藥物，因此被作為飼料添加劑而廣泛使用。隨著人們對食品安全的重視，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品中的己烯雌酚殘留物會導致生物機體代謝紊亂、發(fā)育異?；虍a(chǎn)生腫瘤等危害，是一種致癌物質(zhì)[1-2]。由于生物富集作用，大量使用激素藥物，對環(huán)境也會產(chǎn)生不利影響。因此國內(nèi)外開始在食用性動物飼養(yǎng)中將己烯雌酚列為禁用品，2002年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布176號公告禁止在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用己烯雌酚[3]，綠色食品標準對水產(chǎn)品中要求己烯雌酚不得檢出[4]。

目前水產(chǎn)品中己烯雌酚的檢測方法有：①農(nóng)業(yè)部1163號公告-1—2009《動物性食品中己烯雌酚殘留檢測 酶聯(lián)免疫吸附測定法》[5]，該方法檢出限為2 μg/kg，己烯雌酚的添加濃度水平在3～12 μg/kg時，回收率為60%～110%；②行業(yè)標準SC/T 3020—2004《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的測定 酶聯(lián)免疫法》[6]，該方法檢出限為0.6 μg/kg，回收率≥70%；③農(nóng)業(yè)部1163號公告-9—2009《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量檢測 氣相色譜-質(zhì)譜法》[7]，該方法檢出限為0.5 μg/kg，己烯雌酚的添加濃度為0.5～10.0 μg/kg時，回收率≥70%。己烯雌酚沸點為407 ℃，超出了色譜柱的使用溫度上限(325 ℃)，并且由于己烯雌酚極性較大，會吸附在色譜柱上，對色譜柱有一定的損害，因此需要將己烯雌酚衍生化生成低極性、易氣化的硅烷化衍生物[8]，再用GC-MS/MS檢測，因此衍生化的效果直接影響檢測結果。目前現(xiàn)行標準中己烯雌酚的檢測方法以氣相色譜-質(zhì)譜法為主，因此該試驗通過對氣相色譜-質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚衍生條件進行正交試驗優(yōu)化，簡化前處理過程，減少有機試劑的污染，建立水產(chǎn)品中己烯雌酚的快速、綠色的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗樣品。鱒魚樣品，超市購買。

1.1.2試劑。甲醇、正己烷、吡啶、乙腈、乙酸乙酯，色譜級，瑞典歐普森公司；無水乙醚、無水碳酸鈉，分析純，上海國藥集團；衍生化試劑N-O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)體積比99∶1，上海安譜實驗科技股份有限公司；己烯雌酚標準品(1 000 μg/mL)，上海安譜實驗科技股份有限公司。SLH固相萃取柱，500 mg，6 mL。

1.1.3主要儀器。賽默飛三重四級桿氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，TSQ Quantum XLS，離子源類型為EI，美國Thermo Fisher Scientific 公司；電子天平，ME2002/02型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫氮吹裝儀，JRA-12YW型，無錫杰瑞安儀器設備有限公司；樣品瓶，2 mL，美國Thermo Fisher Scientific公司。渦旋混合器，MX-S型，美國塞洛捷克公司；高速冷凍離心機，湘儀H-2050R型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE100-Pro，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司；固相萃取裝置，57101-U，美國SUPELCO公司。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品前處理過程。取水產(chǎn)品可食用部分充分勻漿→稱取樣品→有機試劑提取→40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干→有機試劑溶解→固相萃取小柱凈化→衍生化試劑衍生后上機待測。

1.2.2樣品的提取與凈化。50 mL離心管中稱取5 g試樣(精確到0.01 g)，加入乙酸乙酯20 mL，渦旋1 min后7 000 r/min 離心10 min。取上層乙酸乙酯溶液于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL乙酸乙酯重復提取1次，合并2次乙酸乙酯提取液。40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL正己烷溶液溶解殘留物，待凈化。

依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化SLH固相萃取柱，取備用液過柱，依次用2 mL正己烷、2 mL乙酸乙酯溶液淋洗小柱，棄淋洗液，將固相萃取柱抽干，依次用10 mL正己烷、乙酸乙酯洗脫，收集于50 mL離心管，40 ℃水浴氮吹干。用1.0 mL正己烷溶解殘留物，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，氮氣吹干，用2.0 mL正己烷復溶，待衍生[9]。

1.2.3衍生化條件的單因素試驗。樣品經(jīng)過提取、凈化后，在樣品瓶中加入衍生化試劑N-O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)(體積比99∶1)，渦旋混勻，在一定溫度下進行衍生化，再氮氣吹干，用1.0 mL正己烷定容，用氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)分析。

在現(xiàn)有標準方法和前期試驗的基礎上，稱取5 g試樣(精確到0.01 g)置于50 mL具塞塑料離心管中，分別以乙酸乙酯為提取試劑，選取SLH固相萃取小柱凈化樣品，衍生化試劑添加量40、50、60、70、80、90、100 μL，衍生化溫度40、50、60、70、80、90、100 ℃，衍生化時間10、20、30、40、50、60、70 min，進行單因素試驗，研究這3個因素對水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的提取效率的影響，均設置3個平行。

1.2.4衍生化條件的正交試驗。以單因素試驗結果為基礎，選取衍生化試劑添加量、衍生化溫度、衍生化時間3個因素進行正交試驗，每個因素設計3個水平，研究這些因素對水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的提取效率的影響，均設置3個平行。

1.2.5氣相色譜-質(zhì)譜條件。色譜柱型號為Thermo TR-PESTICIDE Ⅱ(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min上升至90 ℃保持1.5 min, 以25 ℃/min上升至180 ℃保持1.5 min,然后以5 ℃/min上升至280 ℃，最后以10 ℃/min上升至300 ℃保持5 min。進樣口溫度270 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)；流速1.2 mL/min；進樣量1 μL；進樣方式為不分流進樣；溶劑延遲4.00 min。離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；掃描方式為選擇離子模式(SIM)；己烯雌酚正反式衍生物監(jiān)控離子(m/z)383、397、412、413。己烯雌酚衍生物EI離子源總離子流圖和質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 己烯雌酚衍生物EI離子源總離子流圖(a)和質(zhì)譜圖(b)Fig.1 Total ion current diagram (a) and mass spectrum diagram (b) of diethylstilbestrol derivative EI ion source

1.2.6方法線性考察。取己烯雌酚標準品，用衍生化試劑衍生后，上機檢測，建立0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL標準溶液工作曲線，結果顯示(圖2)，標準溶液濃度在0.2～1.0 μg/mL呈良好的線性關系(R2>0.991 5)。

圖2 己烯雌酚標準曲線Fig.2 Standard curve of diethylstilbestrol

2 結果與分析

2.1 衍生化條件的單因素試驗

2.1.1衍生化試劑添加量對衍生化效率的影響。提取與凈化過程不變，在衍生化溫度為80 ℃、衍生化時間為30 min的條件下，不同的衍生化試劑添加量對回收率的影響見圖3。從圖3可以看出，隨著衍生化試劑添加量增加，衍生化效率提高，但是添加量超過80 μL后，衍生化效果趨于平緩。因此最佳衍生化試劑添加量為80 μL，正交試驗的衍生化試劑添加量確定在70、80、90 μL。

圖3 衍生化試劑添加量對衍生化效率的影響Fig.3 Effect of addition amount of derivatization reagent on derivatization efficiency

2.1.2衍生化溫度對衍生化效率的影響。提取與凈化過程不變，在衍生化試劑添加量為80 μL、衍生化時間為30 min的條件下，不同的衍生化溫度對回收率的影響見圖4。從圖4可以看出，在40～80 ℃時隨著衍生化溫度的升高，衍生化效果有明顯提高，但是80 ℃以后，隨著溫度的升高，衍生化效果反而下降。因此最佳衍生化溫度為80 ℃，正交試驗的衍生化溫度確定在60、70、80 ℃。

圖4 衍生化溫度對衍生化效率的影響Fig.4 Effect of derivatization temperature on derivatization efficiency

2.1.3衍生化時間對衍生化效率的影響。提取與凈化過程不變，在衍生化溫度為80 ℃、衍生化試劑添加量為80 μL的條件下，不同的衍生化時間對回收率的影響見圖5。從圖5可以看出，隨著衍生化時間的延長，衍生化效果明顯提高，超過30 min以后，影響不再顯著，因此為了節(jié)省樣品檢測時間，最佳衍生化時間為30 min,將正交試驗的時間確定在10、20、30 min。

圖5 衍生化時間對衍生化效率的影響Fig.5 Effect of derivatization time on derivatization efficiency

2.2 衍生化條件的正交試驗從表1可以看出，影響衍生化效果的各因素主次為A>B>C，即衍生化時間對衍生化效果的影響最大，其次是衍生化溫度，衍生化試劑添加量的影響最小。方差分析結果表明，因素A的P<0.01，R值大于其他2個因素，說明衍生化時間對試驗結果的影響極顯著；因素B的P<0.05，即衍生化溫度對試驗結果的影響顯著。按照各因素對試驗的影響大小，最終確定的最優(yōu)工藝條件是A3B3C1，即衍生化時間為30 min，衍生化試劑添加量為70 μL，衍生化溫度為80 ℃。

表1 正交試驗結果

2.3 方法的靈敏度在空白樣品中己烯雌酚為未檢出的前提下，取濃度為0.01 μg/mL己烯雌酚標準溶液250 μL，添加到5 g的樣品中，經(jīng)過樣品前處理過程后測定，發(fā)現(xiàn)該方法的定量限為0.5 μg/kg。

2.4 方法的準確度和精密度根據(jù)我國現(xiàn)行的相關法律法規(guī)，在水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程中不允許使用己烯雌酚，因此在水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量是不得檢出，現(xiàn)行標準中定量限為0.5 μg/kg。對鱒魚樣品分別添加濃度為0.5、5.0、10.0 μg/kg的標準品進行添標回收率試驗，結果發(fā)現(xiàn)(表2)，回收率在70.6%～92.7%，滿足試驗要求[10]。

3 結論與討論

截至目前，水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留的國家標準檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法和氣相色譜-質(zhì)譜法。酶聯(lián)免疫吸附測定法主要應用于大批量的陽性樣品的篩查，檢測出陽性樣品時還需要用氣相色譜-質(zhì)譜法進一步確認。因此參考現(xiàn)有標準方法和單因素試驗數(shù)據(jù)的基礎上，選用乙酸乙酯進行提取，SLH固相萃取小柱，進行樣品凈化；以簡化前處理過程和減少有機試劑的使用為目的，通過正交試驗得到較優(yōu)的己烯雌酚衍生化試驗的條件，即衍生化試劑添加量為70 μL，衍生化溫度為80 ℃，衍生化時間為30 min。