王軍珂, 司增梅, 宋彥潔, 王迎春, 李寧△

1青島大學(xué)青島醫(yī)學(xué)院(山東青島 266000)； 2青島大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科(山東青島 266000); 3青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院心臟中心(山東青島 266000)

目前，心力衰竭(heart failure，HF)全球患病人數(shù)已超過3 770萬人，已成為心血管疾病中最常見的類型[1-2]。HF是許多病因繼發(fā)的心臟功能損害的一個(gè)共同的慢性階段，對(duì)患者的正常生活甚至生命安全均有著極大的威脅[3-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNAs)正是近年來臨床研究的熱點(diǎn)之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19(H19)與HF的發(fā)生有關(guān)，被認(rèn)為可能是HF患者有效的生物標(biāo)志物[5-6]。然而，它在HF中的意義仍然很大程度上是未知的。研究發(fā)現(xiàn)，H19可以激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/重組人Smad3蛋白(SMAD family member 3，Smad3)信號(hào)通路，由于TGF-β1/Smad3信號(hào)通路與不同類型的心血管疾病有關(guān)，H19可能在HF發(fā)病機(jī)制中起重要作用[7～9]。Zhuo等[10]在糖尿病心肌病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)H19可通過DIRAS 3影響心肌細(xì)胞的自噬。Zhang等[11]對(duì)300例冠心病患者血漿標(biāo)本中8個(gè)獨(dú)立的lncRNAs的循環(huán)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血漿H19是冠心病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。但是，目前有關(guān)H19與HF的研究還較為少見。 因此本研究旨在探討H19在HF中的臨床意義并通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路影響心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制，這可能為理解HF的分子機(jī)制提供新的見解。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年5月至2021年5月期間，我院收治的327例HF患者作為研究組，50例性別與年齡匹配的單純糖尿病(或高血壓)患者作為對(duì)照組。HF的診斷根據(jù)2017年ACC/AHA/HFSAHF管理重點(diǎn)更新指南中列出的標(biāo)準(zhǔn)[12]。本次研究嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》進(jìn)行，并已獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初步診斷慢性HF至少3個(gè)月；(2)紐約心臟協(xié)會(huì)(New York heart association，NYHA)第Ⅰ～Ⅲ級(jí)；(3)所有研究對(duì)象年齡均>18歲。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有心肌梗死、不穩(wěn)定心絞痛等其他心腦血管疾??；(2)嚴(yán)重呼吸疾病；(3)惡性腫瘤；(4)身體殘疾以及精神疾病。

1.2 血液標(biāo)本采集 采集所有受試者空腹血5 mL，樣品經(jīng)2 000×g離心，4℃離心10 min，血漿保存于-80℃，待用?；颊叩母鞣N生化指標(biāo)均來自我院檢驗(yàn)科檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1.3 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑從血漿(或細(xì)胞)中提取總RNA，根據(jù)制造商的指示(美國Thermo Fisher公司)，使用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(美國Thermo Fisher公司)。采用SYBR-Green qPCR方法對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增分析。反應(yīng)條件：25℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。PCR擴(kuò)增40個(gè)周期，條件為95℃ 12 s，62℃ 40 s。使用GAPDH作為內(nèi)源性對(duì)照，所有PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行歸一化。

1.4 心肌細(xì)胞來源 從1～2日齡Sprague-Dawley大鼠中分離出新生心室肌細(xì)胞。將手術(shù)切除的心肌組織置于37℃的D-Hanks緩沖液(含胰酶1.2 mg/mL和膠原酶0.14 mg/mL)中進(jìn)行消化(美國GIBCO公司)。離心后，將細(xì)胞懸浮在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基/F-12中。分離細(xì)胞在37℃下預(yù)鍍1 h，通過黏附心肌成纖維細(xì)胞分離心肌細(xì)胞。收集心肌細(xì)胞，稀釋細(xì)胞至1×106·mL-1，在37℃和5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 H19低表達(dá)載體(si-H19組)，H19低表達(dá)載體對(duì)照(si-H19對(duì)照組),TGF-β1過表達(dá)載體(pcDNA3.1組)和TGF-β1過表達(dá)載體對(duì)照(pcDNA3.1對(duì)照組)由中國上海Sangon公司設(shè)計(jì)合成。將心肌細(xì)胞培養(yǎng)到70%～80%的濃度，并使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行瞬時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(空白組)和空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為兩個(gè)對(duì)照。

1.6 Western blot RIPA裂解心肌細(xì)胞并提取總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，在室溫下在5%脫脂牛奶中封閉2 h。然后，用TGF-β1 (1∶1 300)、Smad3(1∶1 300)和GAPDH (1∶1 300)一抗4 ℃孵育過夜。隨后，將膜與IgG-HRP山羊抗兔二抗(1∶900)在室溫下孵育2 h(抗體均購買自中國Abcam公司)。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL，中國Sigma-Aldrich公司)進(jìn)行顯影，使用Image Jv1.46軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h后收集心肌細(xì)胞。用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入150 μmol/L H2O2。細(xì)胞培養(yǎng)24 h，然后用0.25%胰酶消化。最后用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC(日本Dojindo公司)染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的特點(diǎn) 兩組性別、年齡等基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而研究組尿酸(uric acid,UA)、氨基末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-B type natriuretic peptide, NT-proBNP)則高于對(duì)照組(P<0.05),左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2 HF患者血漿中H19表達(dá)水平升高 與對(duì)照組(1.00±0.14)相比，研究組HF患者血漿中H19表達(dá)水平(1.83±0.36)明顯升高(t=15.920，P<0.001)，ROC曲線分析顯示，曲線下面積為0.874,H19對(duì)HF的診斷特異度、敏感度分別為98.00%、77.22%。見圖1。

表1 兩組臨床資料分析

圖1 ROC曲線分析H19預(yù)測(cè)HF的敏感度和特異度

H19與HF患者臨床特征的關(guān)系見表2。血漿H19與BMI(r=0.13,P=0.03)、LDL-C(r=-0.25,P=0.02)、UA(r=0.38,P<0.01)、NT-proBNP(r=0.51,P<0.01)、LVEF(r=-0.73,P<0.01)以及高血壓(r=0.16,P=0.03)有關(guān)，與其他臨床特征無關(guān)。進(jìn)一步多因素logistic回歸分析顯示，即使經(jīng)過年齡、性別、BMI、LDL-C、UA、NT-proBNP、LVEF和高血壓等因素的調(diào)整，血漿H19升高仍是HF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.09，95%CI=1.014～1.186，P=0.01)。

表2 H19與HF患者臨床特征的關(guān)系

2.3 沉默H19抑制心肌細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染24 h后，在心肌細(xì)胞中，H19明顯降低(P<0.05)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在H2O2的處理下，抑制H19能夠降低心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)。轉(zhuǎn)染24 h后，在心肌細(xì)胞中過表達(dá)TGF-β1后的H19仍然保持在正常水平，這證明了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路不能調(diào)控H19的表達(dá)(P>0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制H19的表達(dá)水平后，TGF-β1與Smad3在蛋白水平上具有明顯的低水平表達(dá)，這說明H19可能具有TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的調(diào)控能力(P<0.05)。見表3。

表3 H19對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響

2.4 激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用 轉(zhuǎn)染24 h后，在心肌細(xì)胞中，TGF-β1表達(dá)升高(P<0.05)，另外，過表達(dá)TGF-β1促進(jìn)了Smad3的表達(dá)水平。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在H2O2的處理下，TGF-β1過表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表4。

表4 TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路部分恢復(fù)了沉默H19對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用 在H2O2的處理下，心肌細(xì)胞凋亡水平有所上升(P<0.05)，沉默的H19基因的抑制了過表達(dá)的TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對(duì)凋亡水平的調(diào)控。這一實(shí)驗(yàn)說明H19具有對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的調(diào)控能力。見表5。

表5 H19通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

在本研究中，我們分析了H19在HF中的臨床意義以及對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)，H19在HF患者表達(dá)水平升高，并對(duì)HF具有一定的診斷價(jià)值，而且，我們通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H19通過激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。

隨著臨床對(duì)于HF的預(yù)防以及治療手段的進(jìn)展，HF患者的病死率正在逐年下降[13]。但在全球范圍內(nèi)，仍然有17%～45%的住院HF患者在入院后1年內(nèi)死亡，大多數(shù)在入院后5年內(nèi)死亡，產(chǎn)生的臨床治療費(fèi)用對(duì)公眾健康來說是一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)[14]。因此尋找HF的生物標(biāo)志物，制定個(gè)性化的治療方法來調(diào)高患者生存率具有重要意義。H19在冠心病中常表達(dá)升高，并且與冠心病的易感性有關(guān)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HF患者中H19出現(xiàn)表達(dá)水平上升，并且對(duì)HF具有一定診斷價(jià)值，其曲線下面積為0.874，并且H19升高是HF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在Greco等[17]的研究中也顯示，在非終末期HF患者心肌組織中，H19表達(dá)明顯升高，并且與心肌肥厚有關(guān)。但在糖尿病心肌病患者中，H19表達(dá)水平降低，并參與心肌細(xì)胞自噬作用的抑制[18]。因此，我們認(rèn)為還需要更多的研究以及臨床樣本來證實(shí)我們的結(jié)論。

TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在HF發(fā)展過程中被激活[19]，所以抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路被認(rèn)為是治療慢性HF一個(gè)有希望的靶點(diǎn)[20-21]，許多研究報(bào)道TGF-β1/Smad3信號(hào)通路受lncRNA的調(diào)控[22- 23]，最近一項(xiàng)研究報(bào)告表明，H19也能夠激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路[24]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)沉默H19能夠抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路與心肌細(xì)胞的凋亡。值得注意的是，過表達(dá)TGF-β1僅部分恢復(fù)了沉默H19對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。因此，H19也可能與其他細(xì)胞因子相互作用，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡。

H19在HF中呈高表達(dá)，通過激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，參與HF的發(fā)展。

利益相關(guān)聲明：文章所有作者共同認(rèn)可論文不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：王軍珂、李寧參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究，王軍珂論文撰寫，王軍珂、司增梅、宋彥潔、王迎春參與數(shù)據(jù)采集、統(tǒng)計(jì)分析，李寧對(duì)論文的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，指導(dǎo)論文。