海靜, 李文娟, 王文翔, 楊靜, 董學(xué)彩

1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科(河南新鄉(xiāng) 453000)； 2遼寧省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(遼寧沈陽 110016)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)較為常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于中老年女性，國內(nèi)每年新發(fā)病患約13萬例，死亡約5萬例，宮頸癌患者死亡例數(shù)占女性全部惡性腫瘤死亡例數(shù)的18.4%左右[1]。研究證實[2-3]，宮頸癌發(fā)病機制復(fù)雜，涉及遺傳、免疫炎癥、腸道菌群等多種因素，具體發(fā)病機制不清。蛋白屬于基因表達的產(chǎn)物，也是機體生理功能的最終執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學(xué)是指該物種所表達的全套蛋白質(zhì)，通過蛋白組學(xué)進行系統(tǒng)分析能更好的探討復(fù)雜疾病的發(fā)病機制[4]。本研究通過TMT標(biāo)記的蛋白組學(xué)技術(shù)探討宮頸癌患者癌組織中的差異表達蛋白，并進行生物信息學(xué)分析和驗證，以期為宮頸癌的發(fā)病機制和靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入12例于2020年10月至2021年3月于新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院就診的宮頸癌患者作為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者入院后通過術(shù)后組織病理學(xué)確診；(2)首次于我院診斷，既往未經(jīng)過任何治療，且年齡超過18周歲；(3)均進行知情同意且自愿加入研究。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者；(2)存在嚴(yán)重肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病及急慢性感染性疾病患者；(3)臨床資料不完整的患者。

另選取我科室同期12例進行宮頸活檢的患者作為陰性對照，需滿足宮頸活檢后顯示宮頸無任何病變，排除合并肝腎功能不全、感染性疾病、自身免疫性疾病等患者。本研究中將24例研究對象分為實驗組和驗證組，其中10例宮頸癌患者和10例宮頸活檢正常者構(gòu)成實驗組，其余2例宮頸癌患者和2例宮頸活檢正常者構(gòu)成驗證組。所有研究對象均知情同意且簽署知情同意協(xié)議書。該研究經(jīng)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院科研和臨床倫理委員會倫理審查通過(YXLL2019-0107)。

1.2 TMT標(biāo)記的蛋白組學(xué)

1.2.1 樣品準(zhǔn)備、蛋白提取、胰酶溶解、TMT標(biāo)記 樣品準(zhǔn)備：通過手術(shù)及活檢獲得宮頸癌組織和正常宮頸組織，術(shù)后立即采用0.9%生理鹽水沖洗血漬后置于-80℃冰箱中保存。蛋白提?。杭尤胍旱笱心コ煞勰蠹尤隤BS超聲下裂解，再加入等體積的TRIS平衡酚(sigma，美國)離心10 min，離心機轉(zhuǎn)速5 500 r/min，離心半徑r=5 cm。移液管吸取上清液后置入新的EP管中，加入5倍體積的0.1 mol/L乙酸銨(國藥集團，中國)、甲醇(ThermoFisher Scientific，美國)進行沉淀，用甲醇和丙酮(杭州漢諾化工，中國)各洗滌沉淀1次，最后用8 mol/L尿素(Sigma，美國)復(fù)溶沉淀。胰酶溶解：加等量標(biāo)準(zhǔn)蛋白于等體積的各組樣品中，加入RIPA細(xì)胞裂解液(武漢卡諾斯科技有限公司，中國)和二硫蘇糖醇(Sigma，美國)，調(diào)整其終濃度為5 mmol/L，于56℃保溫箱中還原30 min，加入碘乙酰胺(Sigma，美國)調(diào)整其終濃度為11 mmol/L，避光孵育15 min，再次加入TEBA(濟南世紀(jì)通達化工有限公司，中國)稀釋使得濃度低于2 mol/L。以1∶50比例加入胰蛋白酶進行胰酶溶解并過夜(ThermoFisher Scientific，美國)。TMT標(biāo)記：各組的胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex，美國)除鹽后真空冷凍干燥，0.5 mol/L TEAB溶解肽段，TMT試劑盒標(biāo)記肽段，具體操作參考TMT試劑盒說明書進行。

1.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 肽段用液相色譜流動相A相(含有0.1%甲酸和2%乙腈)溶解，繼續(xù)使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)流動相B(含有0.1%甲酸和90%乙腈)進行分離，流速600.00 nL/min。流動相B梯度設(shè)置：0～38 min，8%～23%B；38～52 min，23%～35%B；52～56 min，35%～80%B；56～60 min，80%B。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進行電離然后進QE plus質(zhì)譜進行分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)庫查詢采用PD 2.4軟件進行二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)庫為Homo_sapiens_9606(含有20380條序列)。差異蛋白需滿足adjustP值<0.05且logFC>2或logFC<-2，當(dāng)adjustP值<0.05且logFC>2時為顯著上調(diào)，當(dāng)adjustP值<0.01且logFC<-2時為顯著下調(diào)，

1.3 生物信息學(xué)分析 GO富集分析和KEGG通路分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)在線進行，蛋白與蛋白互作(protein protein interaction，PPI)分析通過STRING在線進行(https://cn.string-db.org/)。GO富集分析包括細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)和生物進程(BP)；KEGG通路分析為將所得到的具有顯著差異的蛋白進行通路富集分析；通過PPI分析構(gòu)建差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。GO富集分析和KEGG通路分析均以P<0.05為差異具有顯著性，PPI分析中將互作評分>0.900作為閾值。

1.4 Western blot驗證 分別取宮頸癌癌組織和正常宮頸組織置于消毒后的研缽中，加入液氮研磨后移入新的EP管，再次加入RIPA裂解液500 μL， 冰上孵育30 min后離心，離心機轉(zhuǎn)速8 000 r/min，離心半徑r=5 cm，提取上清液后置入-80℃冰箱中。取5 μL蛋白樣品進行電泳、電轉(zhuǎn)、牛奶封閉，加入一抗IKKβ(1∶300，萬類生物科技有限公司，中國)、CDK2(1∶500，Abcam公司，美國)、COX4(1∶200，上海雅吉生物科技有限公司，中國)、AKT(1∶500，萬類生物科技有限公司，美國)、Ras(1∶100，Abcam公司，美國)和β-actin(1∶1 000，萬類生物科技有限公司，中國)并4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)孵育1 h。組織中目標(biāo)蛋白相對表達水平=目標(biāo)蛋白的灰度值/β-actin灰度值，重復(fù)測量3次，取平均值。每個條帶的蛋白灰度值采用Image J軟件檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本資料 實驗組和驗證組患者的基本信息如下，實驗組和驗證組兩組基線資料年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組和驗證組中宮頸癌患者組織類型均為鱗癌，TNM分期均為Ⅱ期。見表1。

表1 研究對象的基本資料分析

2.2 宮頸癌癌組織中的差異表達蛋白 共有4 718個蛋白被定量分析，結(jié)果見圖1。相對于正常宮頸組織而言，宮頸癌癌組織中發(fā)生顯著改變的蛋白共有353個，其中上調(diào)的蛋白有190個，發(fā)生顯著下調(diào)的蛋白有163個。見圖1、2。

圖1 蛋白組學(xué)中鑒定到的蛋白基本信息

2.3 GO富集分析和KEGG富集分析 對發(fā)生顯著改變的353個蛋白進行GO富集分析和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，在GO富集分析中，涉及的生物學(xué)過程主要為中性粒細(xì)胞活化、氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答及急性相反應(yīng)等為主；對差異蛋白進行KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要涉及到IL-17信號通路、人乳頭瘤病毒感染相關(guān)通路、PI3K-AKT信號通路、氧化磷酸化、MAPK信號通路等。見圖3、4。

2.4 PPI分析 對宮頸癌癌組織中顯著上調(diào)或下調(diào)的差異蛋白進行PPI分析，將互作評分>0.900作為閾值后共篩選出109個差異蛋白，提示這些蛋白可能是宮頸癌的致病蛋白，見圖5。將109個差異蛋白分別再次進行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，109個蛋白進行GO和KEGG富集分析后的結(jié)果基本和所有差異蛋白的富集結(jié)果基本相一致，主要涉及到免疫炎癥、氧化應(yīng)激、IL-17信號通路等有關(guān)，見圖6、7。按照PPI蛋白交互作用的相關(guān)度排序，我們進一步分析PPI分析中相關(guān)度最為顯著的前5種蛋白，蛋白相關(guān)信息見表2。

2.5 Western blot驗證 我們在驗證組中對上述5種蛋白在宮頸癌癌組織中的表達進行Western blot獨立驗證，結(jié)果顯示，宮頸癌癌組織中IKKβ、CDK2、COX4、p-AKT和Ras蛋白表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

圖2 宮頸癌癌組織中的差異表達蛋白

圖3 453種差異表達蛋白的GO富集分析

3 討論

宮頸癌發(fā)病機制復(fù)雜，目前大多數(shù)研究認(rèn)為，免疫炎癥，尤其是多種信號通路和炎癥介質(zhì)在宮頸癌中的發(fā)病機制中扮演了重要作用[2-3，5]。近年來蛋白組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，通過蛋白組學(xué)能夠很好的探討復(fù)雜疾病的致病蛋白、預(yù)測藥物療效及發(fā)病機制研究。TMT(tandem mass tag)是一種是定量蛋白質(zhì)組學(xué)中經(jīng)典的高通量篩選技術(shù)[6]，然而，目前國內(nèi)尚無通過TMT標(biāo)記的蛋白組學(xué)技術(shù)探討宮頸癌癌組織中的致病蛋白。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌癌組織中發(fā)生顯著上調(diào)的蛋白有190個，發(fā)生顯著下調(diào)的蛋白有163個，經(jīng)過GO和KEGG富集分析后顯示，這些差異蛋白涉及到多種生物學(xué)過程和多種信號通路，這也間接證實宮頸癌發(fā)病機制的復(fù)雜性。GO富集分析中生物學(xué)過程中最為顯著的是中性粒細(xì)胞活化，KEGG富集分析中最為顯著的是IL-17信號通路，IL-17屬于一種促炎因子，這提示宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能主要與免疫炎癥有關(guān)，研究證實中性粒細(xì)胞促腫瘤作用主要與腫瘤血管形成有關(guān)[7]，而血運轉(zhuǎn)移也是宮頸癌常見的轉(zhuǎn)移方式之一，N2型中性粒細(xì)胞可分泌IL-18等趨化因子，通過與腫瘤細(xì)胞表面的CXCR2結(jié)合而參與腫瘤血管的形成[8]，也可直接分泌VEGF和MMP-9刺激腫瘤血管的形成，并促進腫瘤的局部轉(zhuǎn)移和侵襲[9]。通過PPI分析后進一步篩選出了109種和宮頸癌發(fā)病機制密切相關(guān)的蛋白，GO和KEGG富集分析也證實這些蛋白涉及的生物學(xué)過程及信號通路和所有差異蛋白的富集分析結(jié)果類似，提示這些蛋白在一定程度上可代表整體差異蛋白，其中前5種相關(guān)度最高的蛋白如IKKβ、CDK2、COX4、AKT和Ras可涉及與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種生物學(xué)過程及信號通路。

圖4 453種差異表達蛋白的KEGG通路分析

圖5 109種差異蛋白的PPI分析

圖6 109種差異蛋白的GO富集分析

圖7 109種差異蛋白的KEGG通路分析

表2 5種核心蛋白的基本信息

圖8 Western Blot驗證

我們再次對這5種差異蛋白進行獨立樣本驗證，結(jié)果顯示IKKβ、CDK2、COX4、p-AKT和Ras在宮頸癌癌組織中的表達水平顯著升高，與蛋白組學(xué)結(jié)果基本一致，這也進一步證實這5種蛋白可能促進了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。IKKβ在促進腫瘤生長過程中作用顯著，研究顯示[10]，IKKβ能有效逆轉(zhuǎn)阿司匹林對人前列腺癌細(xì)胞的抗增殖及侵襲作用，當(dāng)使用IKKβ抑制劑后能顯著減輕這種效應(yīng)。Li等[11]證實苯乳酸促進宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移主要與其活化IKKβ后進而誘導(dǎo)NF-κB的激活及MMP-9表達上調(diào)有關(guān)，此外，PI3K-AKT-IKKβ信號通路也在宮頸癌發(fā)病機制中扮演了重要作用[12]。CDK2屬于細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases)的家族成員之一，除調(diào)控細(xì)胞周期外，還能調(diào)控多種信號通路而促進腫瘤的發(fā)生，CDK2在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌等中高表達[13]，Gao等[14]發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者化療后癌組織中CDK2蛋白和CDK2 mRNA表達水平得到顯著降低；劉冰潔等[15]發(fā)現(xiàn)CDK2表達上調(diào)可抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡，促進癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等，CDK2涉及的信號通路為p21/Cyclin E/CDK2，主要受NF-κB調(diào)控，張哲等[16]證實NF-κB調(diào)控p21/Cyclin E/CDK2信號通路從而促進宮頸癌細(xì)胞的增殖。Akt和PI3K/AKT信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖過程中發(fā)揮顯著的作用，抑制AKT活化后能有效抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖并促進凋亡[17]。COX4主要影響線粒體功能，參與氧化磷酸化生理過程，目前關(guān)于COX4和宮頸癌的相關(guān)性研究報道較少，但其他研究結(jié)果證實C0X4可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Bikas等[18]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中COX4高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，主要與p70S6K/pS6 和p-ERK信號通路有關(guān)，而蛋白質(zhì)組學(xué)也鑒定出COX4屬于乳腺癌的一項標(biāo)志物[19]。Ras屬于致癌基因已經(jīng)得到共識，Ras及其下游的蛋白參與多種復(fù)雜的信號通路，但與COX類似，Ras如何參與宮頸癌的發(fā)病機制研究報道較少，一項宮頸癌小鼠模型結(jié)果顯示[20]，小鼠血清及血液外泌體中Ras蛋白表達水平顯著升高，此外，化療藥物對宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用也主要是通過抑制Ras及其下游的信號通路[21]。

綜上所述，本研究采用TMT標(biāo)記的蛋白組學(xué)技術(shù)對宮頸癌癌組織和正常宮頸組織中的蛋白進行分析，篩選出差異蛋白并進行生物信息學(xué)分析，初步探討了宮頸癌的復(fù)雜發(fā)病機制及治療靶點，為下一步研究提供了新思路；然而本研究的不足之處在于樣本量較少，日后仍需要大樣本量的研究結(jié)果來驗證我們的結(jié)論。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：海靜是本研究的實驗構(gòu)思和設(shè)計者，負(fù)責(zé)分析蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)及撰寫論文；王文翔是實驗標(biāo)本收集者；楊靜和董學(xué)彩進行蛋白驗證實驗操作；李文娟提供部分蛋白組學(xué)研究經(jīng)費。全體作者均閱讀并同意最終的文本。