劉震營(yíng)，王玲娜，姜 秋，蒲高斌，張永清

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

柏子仁為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟種仁，具有養(yǎng)心安神、潤(rùn)腸通便、止汗等功效［1］。在中醫(yī)藥備受關(guān)注的新形勢(shì)下，柏子仁市場(chǎng)需求量逐年增加，但因黃曲霉毒素含量超標(biāo)造成質(zhì)量不合格的報(bào)道層出不窮。黃曲霉毒素是由黃曲霉菌（Aspergillus flavus）與寄生曲霉菌（A.parasiticus）相互作用產(chǎn)生一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物。中藥材容易受污染的黃曲霉毒素主要有黃曲霉 毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）和G2（AFG2）4 種。其中AFB1毒性最強(qiáng)，有嚴(yán)重的肝毒和致癌、致畸、致突變活性，屬I(mǎi) 類(lèi)致癌物［2］。

柏子仁經(jīng)過(guò)機(jī)器加工時(shí)，很容易破碎，造成油脂外溢現(xiàn)象。在脂肪酸過(guò)氧化物存在下，黃曲霉毒素生物合成涉及脂質(zhì)的氧化降解，且在脂肪酸存在下脂質(zhì)過(guò)氧化和黃曲霉毒素合成均會(huì)加強(qiáng)［3］。柏子仁脂肪油含量可達(dá)48%，為黃曲霉菌生長(zhǎng)及黃曲霉毒素產(chǎn)生提供有利條件［4］。在儲(chǔ)藏方面，一般大都常溫儲(chǔ)藏，少數(shù)采用冷庫(kù)，容易達(dá)到霉菌滋生和毒素產(chǎn)生的條件，需要嚴(yán)格控制環(huán)境條件。目前，關(guān)于柏子仁黃曲霉毒素的報(bào)道大都基于多種藥材黃曲霉毒素的檢測(cè)［5-7］。前人對(duì)水活度、溫度影響中藥材黃曲霉毒素積累的研究已經(jīng)比較深入，不同基質(zhì)黃曲霉毒素最易產(chǎn)生的條件具有明顯差異［8-12］。本研究探討不同水活度和溫度條件下柏子仁黃曲霉毒素的產(chǎn)毒變化，尋找柏子仁在儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)能夠有限規(guī)避黃曲霉毒素產(chǎn)生的安全范圍，有助于優(yōu)化生產(chǎn)、加工、倉(cāng)儲(chǔ)條件，對(duì)柏子仁生產(chǎn)加工具有實(shí)踐性指導(dǎo)意義。

1 材料

SPL-150 生化培養(yǎng)箱（天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；AW1000T 水分活度測(cè)定儀（上海昌琨實(shí)業(yè)有限公司）；ME204／02 萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；5810R 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；DHM-200 多管漩渦混合儀（寧波洛尚智能科技有限公司）；黃曲霉毒素免疫親和柱（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌 鍋（日本Panasonic 公司）；Watson 177-112C 血球計(jì)數(shù)板（北京中西華大科技有限公司）；DM500 生物顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

PDA 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)320H031）；黃曲霉高產(chǎn)毒菌株BNCC142803（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)18051821）；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合對(duì)照品溶液（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)LRAC0310），質(zhì)量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 mg／L。甲醇（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；吐溫-20（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)505Q013）；吐溫-80（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20181205）；甲醇、甲酸（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；溴化鉀（批號(hào)20200526）、氯化鉀（批號(hào)20191005）、氯化鋇（批號(hào)20200509）、硫酸亞鐵（批號(hào)20190504）、硝酸鉀（批號(hào)20140414）、硫酸鉀（批號(hào)20180504）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

柏子仁收集于山東省濟(jì)寧市汶上縣柏子仁加工基地，均為當(dāng)年產(chǎn)且未受黃曲霉毒素污染，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟種仁。

2 方法

2.1 黃曲霉孢子懸浮液制備 將高產(chǎn)毒黃曲霉菌株BNCC142803 轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，待菌落長(zhǎng)滿(mǎn)后用于后續(xù)黃曲霉孢子懸浮液制備。于超凈工作臺(tái)中用接種棒蘸取適量黃曲霉菌與1%吐溫-80 混合，振蕩搖勻，用無(wú)菌滴管吸取少量滴于血球計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下反復(fù)計(jì)數(shù)，制得密度為1×106／mL 的黃曲霉孢子懸浮液，備用。

2.2 水活度調(diào)節(jié) 水活度和溫度是在綜合黃曲霉菌繁殖生長(zhǎng)及毒素產(chǎn)生條件，采用飽和鹽溶液預(yù)平衡法獲得目標(biāo)水活度（0.80、0.85、0.90、0.92、0.94、0.98）［12-14］。選擇相應(yīng)的飽和鹽溶液（溴化鉀、氯化鉀、氯化鋇、硫酸亞鐵、硝酸鉀、硫酸鉀）［15］，將不同種類(lèi)鹽分別放入干燥無(wú)菌培養(yǎng)皿中，向其中慢慢滴加水，直到完全溶解達(dá)到飽和狀態(tài)，將培養(yǎng)皿分別置入干燥器下層（圖1）。稱(chēng)取一定量柏子仁置于干燥無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺(tái)中紫外殺菌2 h 后置于干燥器上層，放上蓋子，使其內(nèi)部形成密閉空間，以達(dá)到不同目標(biāo)的水活度。將所有干燥器放置在25 ℃恒溫實(shí)驗(yàn)室內(nèi)48 h 后，用水分活度測(cè)定儀測(cè)定。

圖1 目標(biāo)水活度調(diào)節(jié)示意圖

2.3 接種培養(yǎng) 將達(dá)到目標(biāo)水活度的柏子仁置超凈工作臺(tái)紫外殺菌2 h，稱(chēng)取80 g 放入已滅菌具塞錐形瓶中，加入3 mL黃曲霉孢子懸浮液，振蕩，混勻，倒入培養(yǎng)皿，均勻鋪開(kāi)。然后置于事先設(shè)定好溫度（20、25、28、32、36、40、42 ℃）并紫外滅菌2 h 的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行樣品。

2.4 黃曲霉毒素含量測(cè)定 稱(chēng)取8 g 培養(yǎng)7 d 后的柏子仁，于液氮中研磨。精密稱(chēng)取5 g，置50 mL 離心管中，加入1 g氯化鈉和25 mL 70% 甲醇混勻，振蕩，渦旋5 min，2 500 r／min 離心3 min，取10 mL 上清液，加入40 mL 1%吐溫稀釋?zhuān)每焖俣繛V紙過(guò)濾，收集濾液為上樣液，待凈化洗脫。取25 mL 上樣液注入免疫親和柱中，待液體排干后，用10 mL 水洗滌2 次，棄去全部洗脫液。待液體排干后，加入1 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液并定容至1 mL。洗脫液用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，用于HPLC-MS／MS分析。

分析條件為HALO 90A C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～4 min，80%～62% A；4～10 min，62%～30% A；10～10.20 min，30%～0A；10.20～15 min，0～80% A）；柱溫40 ℃；體積流量0.25 mL／min；進(jìn)樣量3 μL。電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣體積流量10 L／min；毛細(xì)管電壓4 000 V。4種黃曲霉毒素的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 黃曲霉毒素質(zhì)譜參數(shù)表

3 結(jié)果

3.1 溫度對(duì)柏子仁黃曲霉毒素含量的影響 圖2 顯示溫度對(duì)柏子仁AFB1含量變化的影響，在水活度0.80 時(shí)，20、25 ℃均不產(chǎn)生AFB1。28 ℃開(kāi)始有AFB1產(chǎn)生，但含量相對(duì)較少，隨著溫度升高AFB1含量增加，至32 ℃時(shí)達(dá)到最大，然后逐漸降低，40 ℃時(shí)AFB1含量低于28 ℃。在水活度0.85 時(shí)，AFB1的產(chǎn)生趨勢(shì)與水活度0.80 時(shí)相似，但初始產(chǎn)生溫度從28 ℃降為25 ℃。在水活度0.90～0.92 時(shí)，均為25 ℃開(kāi)始產(chǎn)生AFB1，且產(chǎn)毒量相對(duì)較高，至28 ℃便達(dá)到最高。在水活度0.94～0.98 時(shí)，AFB1最大產(chǎn)生量均發(fā)生在32 ℃，但25 ℃時(shí)水活度0.94 下AFB1產(chǎn)生量明顯高于水活度0.98。

圖2 溫度對(duì)AFB1 含量的影響

對(duì)于AFB2，不同溫度下含量不同（圖3）。25 ℃時(shí)，水活度0.85、0.94、0.98 產(chǎn)毒最多。28 ℃時(shí)，水活度0.90 產(chǎn)毒最多；28～32 ℃區(qū)間不同水活度下均下降；36～42 ℃區(qū)間，水活度0.80、0.85、0.90、0.94 呈先上升后下降的趨勢(shì)；42 ℃時(shí)，不同水活度均無(wú)AFB2產(chǎn)生。AFG1和AFG2在任何溫度下均未檢測(cè)到。

圖3 溫度對(duì)AFB2 含量的影響

隨著溫度升高，黃曲霉毒素總量呈現(xiàn)先上升后下降（圖4）。20 ℃時(shí)，4 種黃曲霉毒素均未產(chǎn)生。隨著溫度升高，不同水活度條件下產(chǎn)毒量逐漸升高，28 ℃為水活度0.85、0.90、0.92 條件下最適產(chǎn)毒溫度，其中在水活度0.90、0.92 時(shí)產(chǎn)毒量已超過(guò)2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。32 ℃為水活度0.80、0.94、0.98 時(shí)最適產(chǎn)毒溫度，隨著溫度升高，黃曲霉毒素總量開(kāi)始下降。在42 ℃，未產(chǎn)生黃曲霉毒素。

圖4 溫度對(duì)AFs 含量的影響

3.2 水活度對(duì)柏子仁黃曲霉毒素含量的影響 圖5 結(jié)果顯示不同水活度下AFB1含量的變化。在20、42 ℃時(shí)，均不會(huì)產(chǎn)生AFB1。25 ℃時(shí)，水活度0.80 無(wú)AFB1產(chǎn)生，水活度0.90 時(shí)AFB1產(chǎn)生量最多。28 ℃時(shí)，水活度0.80 產(chǎn)生AFB1但含量較低。AFB1均在水活度0.90 時(shí)含量最高，且25、28、32、36 ℃下產(chǎn)毒量已超過(guò)限量標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 水活度對(duì)AFB1 含量的影響

AFB2在不同水活度下含量不同（圖6）。水活度0.85時(shí)，25、28 ℃條件下產(chǎn)毒最多。隨著水活度不斷升高，大部分溫度條件下產(chǎn)毒量下降，其中在水活度0.92～0.98 區(qū)間，36、40 ℃條件下產(chǎn)毒量呈先升高后下降。AFG1和AFG2在任何水活度下均未檢測(cè)到。

圖6 水活度對(duì)AFB2 含量的影響

水活度對(duì)柏子仁AFs 的影響參見(jiàn)圖7。隨著水活度升高，黃曲霉毒素總量上升，水活度0.90 時(shí)，黃曲霉毒素總量最高，隨溫度升高下降。

圖7 水活度對(duì)AFs 含量的影響

4 討論

本研究檢測(cè)4 種黃曲霉毒素，除低溫和高溫、部分低水活度條件外，均檢出AFB1、AFB2。水活度作為黃曲霉菌產(chǎn)生黃曲霉毒素的一個(gè)測(cè)定指標(biāo)，表示藥材中的水與其他物質(zhì)結(jié)合的緊密程度，是影響微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一［16］。相比于水分含量，它能夠反映產(chǎn)品儲(chǔ)藏的穩(wěn)定性，廣泛用于藥材質(zhì)量與安全控制。

未來(lái)在柏子仁儲(chǔ)存過(guò)程中，應(yīng)重點(diǎn)防控AFB1和AFs的污染狀況。在28 ℃、水活度0.90 時(shí)，柏子仁的黃曲霉菌產(chǎn)毒能力最強(qiáng)，毒素含量最高。在20、42 ℃時(shí)，水活度變化均不會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素，推測(cè)這2 個(gè)溫度點(diǎn)均限制與黃曲霉毒素產(chǎn)生相關(guān)基因的表達(dá)。一般選擇低溫儲(chǔ)藏，高溫儲(chǔ)藏會(huì)促進(jìn)其他真菌的繁殖生長(zhǎng)。在水活度0.80 時(shí)，各溫度條件下黃曲霉毒素產(chǎn)生量最低。由此可將20 ℃、水活度0.80 作為柏子仁黃曲霉毒素安全控制點(diǎn)。