郭繼芳，韓宇博，金 娟，劉 莉

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細(xì)胞對(duì)外界刺激的一種應(yīng)激響應(yīng)，強(qiáng)烈或持續(xù)的刺激激活凋亡信號(hào)通路，引起細(xì)胞凋亡[1-2]。抑制ERS可保護(hù)心肌，是防治心血管疾病的靶點(diǎn)之一[3]。本研究應(yīng)用異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導(dǎo)SD大鼠心肌損傷，給予參芪益心方治療，檢測(cè)肌醇需求酶1(inositol-requiring Enzyme 1，IRE1)、裂解凋亡蛋白酶-3(Cleaved Cysteine-containing aspartate-specific protease-3，Cleaved Caspase-3)的變化情況，探討參芪益心方對(duì)心肌損傷的保護(hù)機(jī)制與抑制ERS的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(specific pathogen free animal，SPF)級(jí)SD雄性大鼠40只，6～8周齡，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)：SCXK(黑)2019-001，批次No.230729211100021921，體質(zhì)量(200±20)g。動(dòng)物飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心四樓動(dòng)物飼養(yǎng)室，室溫22 ℃，濕度60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可號(hào)：SYXK(黑)2019-003。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：20210901-10。

1.2 主要藥物及試劑 參芪益心方(人參20 g，黃芪20 g，仙鶴草30 g，白術(shù)15 g，茯苓20 g，淫羊藿20 g，桂枝10 g，葶藶子15 g，丹參15 g，益母草15 g，甘草10 g，安徽藥知源中藥飲片有限公司，濃煎至含生藥5 g/mL)，鹽酸異丙腎上腺素(規(guī)格：每瓶5 g，批號(hào)：S31064，上海源葉生物科技有限公司)，鹽酸曲美他嗪片[規(guī)格：每片20 mg，批號(hào)：2019110，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字：H20055465，施維雅(天津)制藥有限公司]；蘇木素(北京索萊寶生物科技有限公司)，伊紅(安徽雷根生物技術(shù)有限公司)，蛋白裂解液(RIPA裂解液)，PMSF(蛋白酶抑制劑)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制Kit，QuickBlockTMWesternTM溶液套裝，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色底物試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，Page Ruler Prestain Protein Ladder彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Thermo Scientific公司)，β-Actin Rabbit Monoclonal Antibody、IRE1 Antibody、Cleaved-Caspase 3 Antibody(Affinity Biosciences公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器 脫水機(jī)、切片機(jī)、包埋機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；RM6240多通道生理記錄儀(成都儀器廠)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD公司)；佳能東芝Aplio i700超聲儀(日本佳能)；恒溫水浴鍋(上海藍(lán)伊科學(xué)儀器廠)；低溫高速離心機(jī)(Eppeadorf 公司)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；超微量核酸蛋白測(cè)定儀(型號(hào)：NanoDrop one，Thermo Fisher Scientific 公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE公司)。

1.4 模型建立 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選取8只作為對(duì)照組，其余32只作為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予頸背部皮下注射異丙腎上腺素建模，誘導(dǎo)心肌損傷，劑量為每日2 mg/kg，對(duì)照組皮下注射等量的生理鹽水，實(shí)驗(yàn)連續(xù)2周。

1.5 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)2周后對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(隨機(jī)選取8只)大鼠進(jìn)行心電圖檢查，超聲心動(dòng)圖確定造模成功。將32只實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為異丙腎上腺素組、曲美他嗪組、參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組，每組8只，早上繼續(xù)皮下注射異丙腎上腺素，對(duì)照組給予等量生理鹽水；每晚各組分別灌胃1次，曲美他嗪組給予曲美他嗪混懸液每日5 mg/kg，參芪益心方低劑量組給予參芪益心方水煎劑每日10 g/kg，參芪益心方高劑量組給予參芪益心方水煎劑每日20 g/kg，對(duì)照組和異丙腎上腺素組給予等量生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)連續(xù)2周。

1.6 心電圖檢查 SD大鼠分別于實(shí)驗(yàn)給藥2周末、4周末，應(yīng)用RM 6240系列多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)usb 3.0a(I)描記心電圖。首先，大鼠吸入異氟烷麻醉后，按照右上肢綠色、右下肢黑色、左下肢紅色連接導(dǎo)聯(lián)線，導(dǎo)聯(lián)線的最前方為齒狀鑷子，鑷子內(nèi)放置針灸針，將針灸針鉗緊并固定，操作時(shí)將針灸針刺入相應(yīng)肢體皮下，注意不要插入肌肉組織，記錄心電圖(速率：40 ms/div，電壓：250 μV)。

1.7 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) SD大鼠分別于實(shí)驗(yàn)2周末、4周末行超聲心動(dòng)圖檢查。大鼠吸入麻醉后，取仰臥位，心前區(qū)至劍突備皮，采用佳能東芝Aplio i700超聲儀，選用探頭頻率14 MHz，與胸骨成20°～30°的夾角，顯示沿二尖瓣瓣口至心尖方向的心臟左室長(zhǎng)軸切面，超聲測(cè)定左室前壁舒張末厚度(Dist A)、舒張末心室內(nèi)徑(Dist B)、左室后壁舒張末厚度(Dist C)、收縮期心室內(nèi)徑(Dist D)，應(yīng)用Teichholtz公式計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.8 心肌組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)4周末采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，用剪刀剪開(kāi)大鼠胸腔取出心臟，心臟組織于4 %多聚甲醛中固定48 h，制備病理切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)心肌組織IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取心尖部20 mg組織，提取總蛋白；超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)濃度；SDS-PAGE凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜；QuickBlockTMWestern溶液套裝封閉振蕩1 h；一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜；洗膜3次；二抗(1∶1 000稀釋)，室溫震蕩孵育1 h；洗膜3次；ECL發(fā)光試劑顯影，曝光，軟件Image J對(duì)目的蛋白條帶行灰度值半定量分析，結(jié)果用目的蛋白/β-Actin比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心電圖變化比較 實(shí)驗(yàn)2周末，實(shí)驗(yàn)組心電圖可見(jiàn)q波，ST段輕度抬高，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組心率增快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。實(shí)驗(yàn)4周末，異丙腎上腺素組q波振幅加深、ST段抬高，且心率較對(duì)照組明顯增快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；曲美他嗪組q波振幅減小，參芪益心方低劑量組ST段抬高幅度減??；參芪益心方高劑量組ST段位于等電位線上，無(wú)明顯偏移，參芪益心方低劑量組、參芪益心方高劑量組相比異丙腎上腺素組，心率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表2。

表1 實(shí)驗(yàn)2周末對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠心率變化比較(±s) 單位：次/min

圖2 實(shí)驗(yàn)4周末大鼠心電圖

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)4周末心率變化(±s) 單位：次/min

2.2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)比較 實(shí)驗(yàn)2周末，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠Dist A、Dist C增加，Dist B、Dist D降低，LVEF、LVFS減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，造模成功。詳見(jiàn)圖3、表3。實(shí)驗(yàn)4周末，異丙腎上腺素組與對(duì)照組比較，大鼠Dist A、Dist C減小，Dist B、Dist D增加，LVEF、LVFS明顯減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與異丙腎上腺素組比較，曲美他嗪組、參芪益心方低劑量組、參芪益心方高劑量組在藥物干預(yù)后各項(xiàng)指標(biāo)均有改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且參芪益心方高劑量組優(yōu)于參芪益心方低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4、表4。

圖3 實(shí)驗(yàn)2周末對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠超聲心動(dòng)圖

表3 實(shí)驗(yàn)2周末對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)變化(±s)

圖4 實(shí)驗(yàn)4周末各組大鼠超聲心動(dòng)圖

表4 實(shí)驗(yàn)4周末各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)變化(±s)

2.3 各組大鼠HE染色結(jié)果比較 對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻，心肌纖維呈束狀規(guī)則排列。而異丙腎上腺素組心肌細(xì)胞肥大、結(jié)構(gòu)紊亂，胞核不規(guī)則，可見(jiàn)核聚集；細(xì)胞間質(zhì)血管充血擴(kuò)張，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞明顯增生；心肌纖維疏松腫脹，排列紊亂，可見(jiàn)肌纖維斷裂與空泡樣變性壞死。與異丙腎上腺素組比較，曲美他嗪組心肌間質(zhì)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維輕度腫脹；參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組纖維排列相對(duì)規(guī)則，斷裂與空泡變性減少，并且參芪益心方高劑量組優(yōu)于參芪益心方低劑量組。詳見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織HE染色(光學(xué)顯微鏡，×200)

2.4 各組大鼠Western Blot檢測(cè)結(jié)果比較 異丙腎上腺素組大鼠心肌組織IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與異丙腎上腺素組比較，曲美他嗪組、參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與參芪益心方低劑量組比較，參芪益心方高劑量組IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 各組大鼠IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)條帶圖

異丙腎上腺素組與對(duì)照組比較，＊ P<0.001；與異丙腎上腺素組比較，# P<0.05；與參芪益心方低劑量組比較，△ P<0.05。

3 討 論

ERS是細(xì)胞在受到應(yīng)激刺激后所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，引起未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)不能被有效清除，導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔異常蓄積。機(jī)體為了對(duì)抗應(yīng)激帶來(lái)的不利損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)維持細(xì)胞存活[4]。ERS發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上調(diào)分子伴侶表達(dá)水平，抑制蛋白質(zhì)再合成，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)及未折疊蛋白質(zhì)的降解緩解ERS[5]。強(qiáng)烈或持久地刺激激活凋亡相關(guān)因子和信號(hào)通路，引起細(xì)胞凋亡。IRE1是ERS的重要調(diào)節(jié)因子，在UPR和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。IREI是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)應(yīng)激信號(hào)的一類(lèi)跨膜感受蛋白，兼具激酶活性和核酸內(nèi)切酶活性。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到應(yīng)激刺激時(shí)，IRE1發(fā)生二聚化和自身磷酸化，激活I(lǐng)RE1上的核糖核酸酶域[7]，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解(ER assocated degradation，ERAD)減少未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蓄積[8]凋亡蛋白酶(Caspases)是促細(xì)胞凋亡的一種蛋白酶[9-10]，處于細(xì)胞凋亡的核心地位[11]。Caspase-3通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)凋亡[12]，可水解DNA酶抑制物、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核骨架成分，引起DNA降解、胞核固縮、核膜分解，產(chǎn)生凋亡小體細(xì)胞凋亡[13]。Caspase-3是最關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，而Cleaved Caspase-3是其活化形式，Cleaved Caspase-3可更有效地評(píng)估細(xì)胞凋亡程度。安琪等[14]研究發(fā)現(xiàn)，丹參可明顯降低葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)、IRE1、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、凋亡蛋白酶-12(Caspase-12)、Cleaved Caspase-3水平，ERS參與并改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷。本研究中異丙腎上腺素組IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯增加，表明ERS參與了心肌損傷，并啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路。

參芪益心方是導(dǎo)師劉莉教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)心力衰竭的本虛標(biāo)實(shí)病機(jī)，以益氣溫陽(yáng)、活血利水為基本治法，制定治療心力衰竭的協(xié)定處方。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)參芪益心方可影響心肌能量代謝[15-17]、改善心功能[18-19]和減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[20]，本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)參芪益心方對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，ERS參與了異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損傷，參芪益心方發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)分子IRE1、Cleaved Caspase-3表達(dá)有關(guān)，且高劑量組效果更明顯。